主题：【第六届原创】苏丹红测试小插曲：都是标准惹得祸

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毛毛儿

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发表于：2011/12/15 09:35:00 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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苏丹红测试小插曲：都是标准惹得祸

毛毛儿

序

源于目前的热点话题---食品安全，实验室拟开展食品中苏丹红Ⅰ—Ⅳ的检测工作，标样的请购已经是半年前的事情，

因为计划不如变化快，诸多临时情况需要及时处理，因此开展此项目已经是标样到货的半年后。

拟开始项目工作前，首先着手试剂、标样的准备工作，一切就绪后，就开始具体实验部分。

正文

1、首先是标准溶液的配制参照国标GB/T 19681-2005食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法中标准溶液的配置方法进行配置：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ各10mg，用乙醚溶解后再用正己烷定容至250ml。根据此标准介绍的方法，我们首先配制各种物质的单独贮备液，然后再根据实际需要各吸取适量标准贮备液或混合，用正己烷定容，配制成相应的标准供试液和标准混合液，摇匀，待测。

2、上机测试：色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18，4.6mm*250mm，5μm，月旭材料科技（上海）提供，或性能相当者；

流量： 1.0ml/min；柱温： 30℃；

检测仪器：高效液相色谱仪，江苏天瑞仪器股份有限公司；

检测波长： 500nm；进样量：10ul；

流动相A： 0.1%甲酸的水溶液:乙腈=85：15；

流动相B： 0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20；

梯度模式如表1所示：

表1.梯度模式

时间/min	0	10	25	32	35
流动相A比例/%	25	25	0	0	25
流动相B比例/%	75	75	100	100	75

首先进行单峰定性，以图说明：

图1为苏丹红Ⅰ在此色谱条件下的色谱图：

图1：苏丹红Ⅰ标准色谱图

图2为苏丹红Ⅱ在此色谱条件下的色谱图：

图2：苏丹红Ⅱ标准色谱图

图3为苏丹红Ⅲ在此色谱条件下的色谱图：

图3：苏丹红Ⅲ标准色谱图

图4为苏丹红Ⅳ在此色谱条件下的色谱图：

图4：苏丹红Ⅳ标准色谱图

通过对各个物质的单标溶液进行定性的时候，问题出来了，苏丹红Ⅲ在此色谱条件下出现了两个大峰，这种情况我还是第一次碰到，然后我们查到当时购买的标样证书，此标样是上海百灵威提供的美国Accustandard，Inc.公司产品，Catalog No:DYE-022N，CAS#:85-86-9，Lot：15547，purity%：100（GC/MS），当时看到这个标准品证书的时候，我们并没有首先怀疑是标样的问题，但是我们试着改变了好几种色谱条件，溶解溶剂，始终是同样的现象：苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ都是出一个单峰，而苏丹红Ⅲ出两个大峰，这使我们没法定性，同时我们也参考了不同的文献资料，通过对其性质的了解，四个物质的性质有相似的地方，出峰情况也应该是相似的。当时因为项目是有时间计划的，于是我开始想办法解决此问题，于是找到了上海一家单位，当时也正做此项目，从他们实验室分给我少许苏丹红Ⅲ的标准物质，当时她们购买的是阿拉丁产品，纯度≥96%（HPLC），于是很快就有了新的标样，我们又开始着手新的标准溶液的配制，图5是阿拉丁产品苏丹红Ⅲ在此色谱条件下的色谱图（此处使用了安捷伦的LC1200进行测试，因为当时LC310在做其他的实验）：

图5：阿拉丁苏丹红Ⅲ标准色谱图

与此同时，我们也进样之前的Accustandard,Inc.苏丹红Ⅲ标准溶液，色谱图如图6：

图6：Accustandard,Inc.苏丹红Ⅲ标准色谱图

奇迹出现了，原来问题真的出在标样本身，于是在接下来的项目里，一方面我们用阿拉丁的苏丹红Ⅲ和Accustandard,Inc.的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ标准物质进行后面的实验部分；另一方面我开始联系百灵威，将此情况反馈至美国工厂，此处暂告一段落。

3、标准物质的定性工作结束后，我们开始着手混标的重现性、线性等实验，在按照国标提供的标准贮备液和溶液的配制方法，从而配制的混标溶液进样后，重现性明显达不到国标的要求，而且苏丹红Ⅱ的峰形较差，拖尾因子0.80，理论板数3707，而其他三个理论板数均大于2万；与此同时，保留时间的重现性很差，连续进样6针的混标谱图叠加效果，以图7说明：

图7 ：重现性谱图

通过查找原因，出峰时间一针比一针提前，根据配制的实际情况，因为配制时使用了乙醚，属于极易挥发溶液，导致出峰时间有所偏移，根据苏丹红物质本身的性质，在丙酮中的溶解性较好，于是我们重新配置标准溶液，以丙酮为溶剂，进行标准贮备液和标准混合溶液的配置，连续进样6针的效果比国标要好，以图8为真相说明：

图8：以丙酮为溶剂的混标谱图

通过对图7和图8的的比较，图8在峰形和保留时间的重现性上都明显优于图7。在接下来的项目按照预定计划进行着，还算顺利。

4、在前面第2部分的结尾处暂告一段落的事情，在项目接近尾声的时候，也有了一定的说法，百灵威业务给我来电，说工厂那边愿意赔偿我一支苏丹红Ⅲ标样或者退钱，我当时选择了重新更换一支新的标样，因为我想看看新的标样会是什么情况，于是业务很快安排给我寄来了新的标样，我兴冲冲地收到快递去实验室，正好第二天没有太多的实验工作，于是我们将前后两次标样进样对比，结果没有我们想象的好，出峰与之前的出峰简直就是双胞胎，然后我将两次的标准品证书进行比较，发现证书上面的Lot号是一模一样的，都是15547，据此推断是同一批货，于是我又电话联系了百灵威，他们的回答确实是这样的，但是据他们讲，此标样之前也卖给其他的客户，但是没有客户反映此种情况，但是问题是我们用液相做的结果就明明白白地摆在那里，为了向工厂讨个说法，我们将两次的测试谱图以及阿拉丁标样的谱图一同整理发给了美国工厂，直到今天我还没有得到工厂那边的任何回复，继续等待中……

5、小结

通过此次实验中遇到的大大小小事件，总结如下：

虽然经常听身边的人讲，国标不一定就是标准，但是至少还是有参考的价值吧，在我看来，国标不是个个都是精品，需要自己去验证是否真的可行，当然我也不了解国标的认证过程，因为俺不是那方面的专家，我只希望达到我要的实验效果，足矣！

标样的风波：此种情况已经不是第一次出现了，在之前同事也遇到过同样的情况，但是当时工厂那边的回复是相当迅速的，这一次不知道会是什么情况了？告诫大家，当分析出现异常情况时，还是要考虑标样是否可靠，当然作为色谱分析者来讲，如果标样都不可靠了，我不知道还有什么是可靠的，说起来也算是个悲哀吧。

虽然本次实验一波三折，但是最后还是顺利完成了，而且有了些新的体会，还是值得庆幸的，如果每次实验都是一帆风顺的，我想也不见得就会有所提高，所谓的在问题中成长吧。

作为一名微不足道的色谱工作者，谨以此作为给自己及大家的一点点感想发发而已！对或不对，都非常感谢您提出来我们一起讨论！

附件：

苏丹红测试小插曲---都是标准惹的祸.doc

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