主题：【第七届原创】色谱法同时分析磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱和游离脂肪酸

                色谱法同时分析磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱和游离脂肪酸

    磷脂容易被氧化和水解从而降解(如下图)，这就限制了有磷脂的药物制剂（脂质体、乳剂）的稳定性及保质期.

    溶血磷脂和脂肪酸的产生量是判断药物制剂适宜性的关键参数，如随着脂质水解程度变化脂质体分子组成由层状变为胶束就会伴随着药物释放速度的改变。有报道称大量LPC的形成会导致油滴变大导致磷脂与肠胃液稳定相的聚合和破裂，从而导致毒副作用。

    美国FDA要求制药企业对于脂质体药物建立适当的储存条件，并在进行稳定性研究时对脂质体药物进行脂质成分分析。这就要求合适的方法对不同化合物的准确定性及定量分析。由于分子中缺乏足够的发色团，以至于紫外和荧光检测不适于对于脂质体的直接分析。蒸发光散射检测器（ELSD）并不需要衍生化，可作为磷脂检测的快速灵敏的手段。蒸发光散射通过测定溶剂蒸发后被检测物散发光的强度进行分析。该方法允许梯度洗脱并对流速不敏感，且相对于LC-MS更方便和便宜。

    材料和方法：L-α磷脂酰胆碱、L-α溶血磷脂酰胆碱、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、甲醇(色谱纯)、氯仿(色谱纯)、氢氧化铵（分析纯）、去离子水。

旋转蒸发仪、超声仪、沃特斯2695配低温政法光检测器、Allsphere硅胶色谱柱（150mm×4.6×5um）、Millennium32色谱工作软件。

    磷脂酰胆碱脂质体悬浮液通过蒸发-水化法制备，称取0.224g PC溶解于50ml氯仿中，转移至250ml圆底烧瓶中，使用氮气流蒸发氯仿而形成薄的脂质膜，最后通过旋转蒸发仪除去痕量的氯仿，脂质膜用50ml的0.9％NaCl溶液于40℃进行水合，将脂质体浓缩至4.48mg/ml，得到的多层囊泡悬浮液经超声30分钟以获得单层脂质体，脂质体用0.1 N NaOH 调节PH在9-10之间。121℃高压灭菌15分钟。室温保存备用。

    标准和样品溶液的制备:

    以氯仿：甲醇（50：50％，体积/体积）为溶剂分别制备PC，LPC和亚油酸含量为5mg / mL的储备液，冷冻避光保存备用。

    标准曲线系列浓度配制范围PC为82–816 μg/mL，LPC为30–250 μg/mL，亚油酸为55-290μg/mL。

    混合标准为同浓度的PC、LPC亚油酸酸，油酸，硬脂酸，和棕榈酸。

    FFA的样品是由相等浓度的油酸，亚油酸、硬脂酸和棕榈酸制备。

    样品溶液是通过将0.5毫升脂质体加入氯仿：水（50：50％，体积/体积）的溶剂体系。

    液相分析：梯度洗脱情况如下

A 氯仿

B 氯仿：甲醇（70：30％，体积/体积）

C 氯仿：甲醇：水：氢氧化铵（45：45：9.5：0.5％，体积/体积/体积/体积）

流速：1.0ml/min 柱温 28度进样量20ul.

ELSD条件包括：漂移管温度的40℃，增益6，雾化气体压力3.2bar.

    结果与讨论：

    标准的色谱图：

    由标准色谱图得知混合游离脂肪酸的出峰时间在6.7min,PC出峰时间为12.2min,LPC出峰时间为14.7min.

    脂质体HPLC-ELSD色谱图：

    结果与讨论：

    1、本实验开发了一种同时测定磷脂酰胆碱（PC），及其降解产物溶血磷脂酰胆碱（LPC）和游离脂肪酸(FFA)的色谱方法，对于安全可靠的评价磷脂产品的稳定性提供了简单的分析方法。

    2、本试验采用ELSD配合高效液相色谱法同时测定磷脂酰胆碱及其降解产物溶血磷脂酰胆碱和游离脂肪酸，方法灵敏度高、重现性好。本试验没有基线漂移适用于各种基于磷脂的脂质体分析。

    3、本方法使用正相高效液相色谱法，配蒸发光散射检测器，Allsphere silica色谱柱，梯度洗脱条件为氯仿：甲醇=70:30和氯仿：甲醇：水：氨水=45:45:9:1,游离脂肪酸测定以亚油酸作为对照。

    4、磷脂酰胆碱的标准曲线在1.64–16.3μg范围内r2=0.9991。溶血磷脂酰胆碱标曲在0.6–5.0 μg,范围内r2=0.9996. 磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的定量检测限分别为0.04ug和0.1ug。

    5、为了验证该方法对于药品检测的适用性，我们将磷脂酰胆碱脂质体进行碱水解，定量分析显示为总量磷脂酰胆碱的97%。实验表明该方法适用于磷脂酰胆碱药物色谱分析，稳定性研究。