关于”新版GB 2763 食品安全国家标准 规定茶叶中限量农残草甘膦和草铵膦项目“的检测研究
一、研究意义及现状
随着新版GB 2763 食品安全国家标准的不断更新及发布实施,草甘膦和草铵膦已被明确列为茶叶中农药残留强检(必检)项目,草甘膦在茶叶中的限量为1mg/kg,草铵膦在茶叶中的限量为0.5mg/kg。同时,草甘膦和草铵膦也成为中国茶叶出口国外的检测项目(来源于中华人民共和国商务部),且已成为越来越严的限量指标。 文献(2013年农药行业预测和草甘膦市场机遇分析,杨益军,农药市场信息,2013.03)报道,除草剂草甘膦因其高效、广谱、低毒等特性使其被广泛应用,未来需求量也将大幅增加。但草甘膦的使用容易使植物产生抗性(IARC国际研究机构发布报告称草甘膦很可能对人类致癌),而草铵膦可克服该缺陷,现已有学者(草铵膦、百草枯、草甘膦对非耕地杂草的防效比较,凌进,农药,2014年第53卷第8期,613-615)对草铵膦和草甘膦的除草性能进行了研究,确证了草铵膦代替草甘膦的可行性。
因草甘膦和草铵膦为广谱除草剂,被广泛应用于农业、林业及园艺的栽培。我国作为农业大国,其茶叶产量世界第一、出口量世界第二,草甘膦和草铵膦的生产和使用量都位居世界前列(草甘膦 草铵膦及其代谢产物的检测方法,李小娟、周信康、孟品佳,公共安全中的化学问题研究进展)。同时,我单位对西南茶叶原料主产区进行了初步调研,进一步确认茶农使用草甘膦和草铵膦农药的现状。
随着草甘膦和草铵膦除草剂使用量的日益增大,使其常被发现存在于环境水样、土壤及植物中,这样长期积累会引起环境污染,从而对人类健康造成严重威胁。草甘膦和草铵膦结构类似,且均含有膦酸基、羟基、氨基,是极强的两性化合物,易溶于水,难挥发。鉴于草甘膦和草铵膦特殊的物化性质和茶叶基质自身的复杂性,无论国内外,茶叶中草甘膦和草铵膦同时检测的标准还未见发布。
目前,可用于检测草甘膦和草铵膦农药残留量的主要方法有液相色谱法,柱前衍生后气相色谱法、气相色谱-质谱法及液相色谱-质谱/质谱法。
快速发展起来的超高效液相色谱-质谱联用技术,具有检测灵敏度高、适用范围广、分析速度快和能有效排除复杂基质产生的干扰等优点,当今已成为检测型实验室检测农残的首选。然而,若采用液质质直接测定草甘膦和草铵膦,则仪器响应较低,无法满足茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量检测的要求。
近两年来,已有研究文献陆续发表,用柱前衍生-液相色谱串联质谱法检测。笔者结合其文献研究结果,对茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量的检测方法系统地进行研究,采用9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)作为常用衍生剂,在硼酸盐缓冲盐溶液的条件下,能与草甘膦和草铵膦的提取液发生衍生反应,形成衍生产物,衍生产物注入UPLC进行色谱洗脱分离,采用串联质谱探测响应信号,外标法直接快速定量茶叶中的草甘膦和草铵膦的含量。
二、液质质检测分析原理
质谱原理是先将物质离子化,按离子的质荷比分离,然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。液质联用是将色谱的分离能力与质谱强大的定性功能结合起来,实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析,简化样品的前处理流程,使样品分析更简便。主要针对不挥发性、极性、热不稳定、大分子量等化合物的分析测定。液质联用检测技术灵敏度高,且串联质谱(三重四级杆)定性准确,可有效杜绝微量甚至痕量物质分析时的假阳性现象,常用于目标物质的痕量分析。
采用柱前衍生-液相色谱串联质谱法检测茶叶中的草甘膦和草铵膦有以下优势:
1)、灵敏度高、线性好、检出限低(可达ng/mL级及其以下);
2)、定量结果准确、稳定、重复性好;
3)、实验操作简单、步骤少、耗时短、分析速度快、检测效率高;
4)、实验试剂无污染、无毒、安全;
5)、有效减弱基质对目标物检测的影响。
三、茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量检测的前处理试验
茶叶经GB/T8303磨碎、过筛制得待测茶样(发酵茶应先低温去除水分,使样品易于磨碎);
准确称取已磨碎处理过的茶样1g(精确至0.001g)置于80mL具盖离心管中,加入10mL水,涡旋混匀静置,加入2mL二氯甲烷,混匀,超声提取或回旋振荡10min,低速离心机4500r/min离心5min,取上清液,制得提取上清液;
注意:若茶样为新采摘的鲜叶,则称取约5g鲜叶于研钵中,加入30mL水,研磨约10min,将其转入离心管中,用10mL水洗涤研钵后转移至离心管,重复洗涤一次,再次加入10mL二氯甲烷于离心管,均质至混匀,4500r/min离心10min,取上清液,制得提取上清液;
将提取上清液用净化柱CAX、C18,以及活性炭小柱等进行比对试验,确定以C18小柱净化提取液,制得提取净化液;
通过缓冲液浓度、衍生液浓度、衍生液用量、缓冲液用量、净化液用量,衍生时间等条件试验,得出最优衍生试验参数为缓冲液浓度为50g/L,衍生液浓度20g/L,衍生液用量:缓冲液用量:净化液用量的体积比为1:1:1,衍生时间为约3h,衍生液过0.22μm的有机滤膜后进样。
四、茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量检测的衍生机理
茶叶中草甘膦和草铵膦农药残留量的衍生机理为:在硼酸钠缓冲盐溶液条件下,草甘膦(分子结构如图1所示)和草铵膦(分子结构如图2所示)中R-NH-R’的-H被FMOC-Cl(分子结构如图3所示)中的FMOC-取代,生成 ,得到衍生目标产物草甘膦衍生物和草铵膦衍生物。 其中,草甘膦分子结构图,见图1;草铵膦分子结构图,见图2;9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)分子结构图,见图3;草甘膦和草铵膦与9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)的衍生机理图,见图4。
五、茶叶中草甘膦、草铵膦农残衍生物在质谱中的裂解机理
1、茶叶中草甘膦农残衍生物在质谱中的裂解机理
通过对草甘膦衍生物在串联质谱中的裂解机理进行系统的分析研究,可探索出草甘膦衍生物的裂解机理为:首先草甘膦衍生物裂解为离子m/z 214,离子m/z 214流经碰撞室期间会自动失去一个CO2分子而变为离子m/z 170,离子m/z 170在碰撞室内与惰性气体氩气发生有效碰撞,再次裂解为离子m/z 88。
2、茶叶中草铵膦农残衍生物在质谱中的裂解机理
通过对草铵膦衍生物在串联质谱中的裂解机理进行系统的分析研究,可探索出草铵膦衍生物的裂解机理为:首先草铵膦衍生物裂解为离子m/z 208和离子m/z 226,离子m/z 226流经碰撞室期间会自动失去一个CO2分子而变为离子m/z 182,离子m/z 182在碰撞室内与惰性气体氩气发生有效碰撞,再次裂解为离子m/z 136。
六、定性定量参数的研究和确定
草甘膦和草铵膦的定性、定量参数研究结果,如下表1。
表1. 草甘膦和草铵膦的定量、定性参数
序号 | 标物名称 | 保留时间 | 定量/定性离子对 |
1 | 草甘膦 | 2.53min ~ 2.58min | 392/88 392/214 |
2 | 草铵膦 | 2.65min ~ 2.73min | 404/136 404/208 |
七、草甘膦和草铵膦标准曲线的绘制
通过草甘膦和草铵膦标准物质浓度的配制,采用液相色谱-串联质谱扫描谱图,制作出草甘膦和草铵膦的标准曲线如下表3,进一步得到该方法的检出限(LOD)和检出量(LOQ)。
表2. 草甘膦和草铵膦标准曲线绘制及相关参数确定
分析物名称 | 线性方程 | 线性范围(μg/mL) | r2 | 曲线斜率 | 检出限 LOD(mg/kg) | 检出量 LOQ(mg/kg) |
草甘膦 | y=295341x+106.22 | 0.005~0.50 | 0.9981 | 295341 | 0.003 | 0.010 |
草铵膦 | y=237983x+803.19 | 0.01~0.50 | 0.9946 | 237983 | 0.005 | 0.015 |
八、回收率验证
对上述研究结论进样回收率验证试验,验证结果如下表3。
表3. 回收率验证试验结果
序号 | 标物名称 | 回收率范围 | RSD |
1 | 草甘膦 | 75.37% ~ 113.36% | 10.35% |
2 | 草铵膦 | 82.14% ~ 125.71% | 9.77% |
八、实际样品检测
笔者随机抽取多份西南区茶叶原料进行检测,该方法检测稳定、准确、重现性好。