1 引言
咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，能够暂时的驱走睡意并恢复精力。有咖啡因成分的咖啡、茶、软饮料及能量饮料十分畅销，因此，咖啡因也是世界上最普遍被使用的精神药品。但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，因此，为保障人们科学、定量的摄入咖啡因，对保健品中咖啡因含量进行快速、准确检测十分有必要。
目前测定咖啡因的方法有很多，如核磁共振法、高效液相色谱法、紫外分光光度法和液相色谱质谱联用法等。液相色谱质谱法测定咖啡因的方法还比较少，且专属性不够强。本文采用液相色谱-串联质谱法测定保健品中咖啡因的含量，具有测定快速准确、精密度高重现性好等特点，具有很大的选择性，高效，低耗，快速，应用广泛。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；质谱仪（API3200，美国AB公司）；XP205分析天平(METTLER TOLEDO)；KQ-500VDE型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、咖啡因标准品（来源：北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；批号：GBW(E)100174；浓度：0.50mg/ml）。、

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm, 2.7μm）；流动相：0.1%甲酸溶液+乙腈=80+20（v/v），等度洗脱；流速：0.4 mL/min ；进样量：5μL。

2.3 质谱条件

（1）以电喷雾离子源（ESI）阳离子模式，气帘气 20psi；碰撞气 6psi，喷雾电压 5500V；离子源温度 600℃；雾化气 50psi；时间 6min。

（2）咖啡因质谱参数，见表1。

表1 咖啡因的质谱MRM检测条件

Table 1 Mass spectromwtry MRM monitoring conditions of caffeine

母离子Q1	子离子Q3	扫描时间（msec）	去簇电压（V）	入口电压（V）	碰撞电压（V）	碰撞室射出电压（V）
195.1	138.1	200	70	10	27	10
195.1	123.1	200	70	10	40	10

2.4 标准溶液的制备

(1) 标准储备液的配制

分别精密吸取0.50mg/mL咖啡因标准液制成五个对照浓度；分别为0.8μg/mL、1.6μg/mL、2.4μg/mL、3.2μg/mL、4.0μg/mL的工作标准液，经0.45μm的微孔滤膜过滤，进样量为10μL，以浓度C（mg/mL）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准工作曲线。

2.5 样品前处理

取试样20片或10g，研细，混合均匀，精密称取样品约0.1g，置于100ml棕色容量瓶中，加入适量50%甲醇，置40℃超声（功率500W，频率50kHz）处理至提取完全（约15min），冷却至室温，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，离心，经0.45μm的滤膜过滤，即得。
3 结果与分析
3.1色谱行为
采用液相色谱串联-质谱法能快速检测保健品中的咖啡因，不会因为其他因素而影响检测。采用01%甲酸溶液和乙腈和按一定的比例等度进行洗脱，6min就能把样品中咖啡因流出，流动相的比例也能让咖啡因不受其他杂质峰的影响，达到准确的分离和定量。见图1和图2。

图1 咖啡因标准品的色谱图

Fig.1caffeine standard of chromatogram map

图2 样品的色谱图

Fig.2 the chromatogram map of the sample

3.2 线性实验

表2 线性实验结果

Table 2 Linear experimental results

序号	浓度C（μg/mL）	咖啡因峰面积(A)
STD1	0.8	17200
STD2	1.6	29200
STD3	2.4	40900
STD4	3.2	52600
STD5	4.0	64200
线性方程	y = 16780 x
相关系数(R2)	0.9999

线性实验结果如表2所示，相关系数R²为0.9999，所以用该方法测定咖啡因的含量，在浓度为0.8 μg/mL~4.0 μg/mL之间呈现良好的线性。
3.3定量限和检出限
分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比（S/N）计算。DL定义为S/N=3时对应的待分析物浓度，QL定义为S/N=10时对应的分析物浓度。当信噪比（S/N）为3时，咖啡因检出限为0.002μg/mL，得到方法的咖啡因检出限为1.0μg/g。以S/N=10定方法的检测浓度为QL=0.0067μg/mL，得到方法的咖啡因定量限为3.3μg/g。
3.4 稳定性实验
取咖啡因标准品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h进样，其峰面积的RSD=0.90%，说明咖啡因标准溶液在24 h内较稳定，结果见表3。

表3稳定性实验结果

Table 3 The precision of stability results

时间/h	0	2	4	8	12	24	RSD/%
组分
咖啡因	33000	33800	33400	33500	33300	33200	0.9

3.5 精密度实验
精密称取样品6份，按1.3.2试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD（%）。6个样品的相对标准偏差（RSD）为1.40%，具有良好的精密度，结果见表4。

表4精密度实验结果

Table 4 The precision of experimental results

序号	称样量（g）	浓度（μg/mL）	含量（%）	平均含量（%）	RSD（%）
1	0.10056	1.99	0.0989	0.0098	1.40
2	0.10094	2.02	0.100
3	0.10031	1.94	0.0967
4	0.10025	1.96	0.0977
5	0.10004	1.93	0.0964
6	0.10075	1.97	0.0977

3.6 加标回收率实验
精密称取约0.1g样品9份，置于50mL棕色容量瓶中，分成3组，每组3份，于每一组中分别精密加入咖啡因标准品（浓度为50μg/mL）1.40mL、1.70mL、2.00mL，加入50%甲醇适量，置40℃超声（功率500W，频率50kHz）处理至提取完全（约15min）以冷却至室温，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，离心，经0.45μm的滤膜过滤，作为加标样品溶液，按色谱条件进行检测，结果见表5。

表5加标回收率实验结果

Table 5 Standard addition recovery experiment results

序号	样品称样量（g）	样品浓度（μg/mL）	测得对照品量（μg/100g）	加标量（μg/100g）	回收率（%）	平均回收率（%）	RSD（%）
1	0.11555	2.30	103.7	100	103.67	100.8	2.3
2	0.11518	2.26	101.7	100	101.71
3	0.11509	2.32	104.7	100	104.72
4	0.10307	2.64	121.9	120	101.58
5	0.10116	2.59	119.6	120	99.65
6	0.10117	2.57	118.6	120	98.82
7	0.10129	2.98	139.1	140	99.33
8	0.10137	2.96	138.1	140	98.61
9	0.10205	2.98	139.0	140	99.28

从表3中可以看出，在不同添加水平下，保健品中咖啡因方法的回收率范围为95.0~105.0%，平均回收率为100.8%，相对标准偏差（RSD）为2.3%。
4小结
本文通过液相色谱串联质谱法对保健品中的咖啡因含量进行了测定，通过检测其线性范围，检出限，定量限，精密度，稳定性和回收率实验，结果令人满意，表明该方法具有准确性好，精密度高和重现性好等优点，可用于保健品中咖啡因含量的检测。