2.1 色谱柱：以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂（柱长10cm，内径4.6mm，粒径2.7μm ）或同等性能的色谱柱
2.2 柱温：40℃
2.3 流速：0.4mL/min
2.4 流动相：精密称取0.386g乙酸铵，加水500ml溶解，加入500ml乙腈，混合，用乙酸调pH=3.5，过滤，即得。
2.5 质谱条件：ESI+ 模式，L-羟脯氨酸参数如下：
ESI+ 模式

Q1	Q3	Time(msec)	DP	EP	CE	CXP
132.071	86.1	150	36	6	23	4
132.071	68.0	150	36	6	29	14

132.071为母离子碎片，86.1为定量离子碎片，68.0为定性离子碎片。

CUR	CAD	IS	TEM	GS1	GS2
20	6	5500	600	50	50

时间： 6.0min
2.6 溶液制备
2.6.1对照品溶液的制备：
精密称取L-羟脯氨酸对照品50mg，置于25ml容量瓶中，加入适量0.1%甲酸溶液溶解，定容，摇匀，作储备液，备用。精密量取L-羟脯氨酸储备液,用0.1%甲酸溶液配成浓度约10μg/mL的对照品溶液。
2.6.2 标准工作曲线绘制：
分别精密吸取对照品溶液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL及供试品溶液2μL，注入高效液相色谱仪，建立标准曲线方程。供试品色谱中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰定量。
2.6.3 供试品溶液的制备：
取试样适量，精密称取样品0.1g，置于50mL消解管内，加入浓盐酸10mL，加入2滴苯酚，
于80℃石墨消解炉内消解10min，取出冷却，转移至微波消解仪上消解60min，取出冷却，将水解液全部转移至50mL容量瓶中，用一级水定容至刻度，摇匀，过滤，精密吸取1mL于10mL容量瓶中，置于真空干燥箱内，于50℃减压干燥（真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂），干燥后残留物用0.1%甲酸溶液定容至刻度，摇匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，即得。
微波消解程序：

步骤	爬升时间/min	保持时间/min	温度/℃	功率
1	10	50	150	1800

2.7 结果计算
X=V×C×K/M
式中： X—试样中L-羟脯氨酸的含量，g/100g；
C—试样溶液中L-羟脯氨酸的浓度，μg/mL；
M—试样的质量，g；
V—试样稀释的体积，mL。
K-单位转换系数，0.0001。
3 方法学验证（产品：胶原蛋白大豆肽粉）
3.1 方法空白实验
3.1.1 试验方法：
不称取样品，按2.6.3试样制备方法处理空白溶液，按5.1色谱条件测定空白溶液，与L-羟脯氨酸对照品溶液的出峰时间对比。
3.1.2试验结果：

试验结论：空白溶液在L-羟脯氨酸的出峰时间处均无吸收峰，表明空白对测定结果基本无干扰。
3.2 线性范围确认
3.2.1试验数据：（色谱图见附图）

组分	标准序号	浓度/（μg/mL）	峰面积/A
L-羟脯氨酸	1	10.32372	4.79e+006
	2	20.64744	8.04e+006
	3	30.97116	1.13e+007
	4	41.29488	1.42e+007
	5	51.61860	1.71e+007
	线性方程	y =3E+06x + 2E+06
	相关系数	0.9995

3.2.2标准工作曲线图：
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如下图所示：

线性试验结论：L-羟脯氨酸的相关系R为0.9995，所以用该方法测定L-羟脯氨酸在浓度10.32372μg/mL至51.61860μg/mL之间，呈现良好的线性。
3.3 检出限和定量限
当信噪比（S/N）为3时，L-羟脯氨酸检出限为0.000412949μg/mL，得到方法的L-羟脯氨酸检出限为2.06474μg/g。
当信噪比（S/N）为10时，L-羟脯氨酸定量限为0.001238846μg/mL，得到方法的L-羟脯氨酸定量限为6.1942μg/g。
3.4 精密度试验
3.4.1 试验方法：
将L-羟脯氨酸的对照品溶液按5.1色谱条件重复测定6次，计算其峰面积RSD(%)。
3.4.2试验数据：

序号组分	1	2	3	4	5	6	RSD/%
L-羟脯氨酸	4740000	4640000	4710000	4790000	4740000	4690000	1.1

试验结论：L-羟脯氨酸重复测定6次峰面积的RSD（%）为1.1%，表明该方法有较好的精密度。
3.5 稳定性试验
3.5.1 试验方法：
将L-羟脯氨酸对照品溶液分别在室温下放置0h、2h、4h、6h、8h、10h后，按5.1色谱条件测定峰面积，计算其RSD(%)。
3.5.2 试验数据：

时间/h 组分	0	2	4	6	8	10	RSD/%
L-羟脯氨酸	4770000	4810000	4810000	4860000	4840000	4840000	0.8

试验结论：L-羟脯氨酸对照品溶液分别在室温下放置0h、2h、4h、6h、8h、10h后，RSD（%）为0.8%，表明L-羟脯氨酸对照品溶液在室温下10小时内的稳定性良好。
3.6回收率试验
3.6.1试验方法：
加标：精密称取约0.1g样品9份（已知L-羟脯氨酸）含量为：6.5g/100g），置于50mL消解管中，分成3组，每组3份，各组分别精密加入L-羟脯氨酸标准液（浓度为2.0647
mg/mL）2.60mL、3.30mL、4.00mL。按5.2试样制备方法处理样品。
3.6.2 试验数据：

组分	序号	称样量/mg	体积/mL	浓度/μg/mL	测得加入量/g/100g	加标量/g/100g	回收率%	平均回收率%	RSD%
L-羟脯氨酸	1	0.11234	500	25.4	0.539790	0.536822	100.55	99.0	1.6
	2	0.11295	500	25.6	0.545825	0.536822	101.67
	3	0.10933	500	24.9	0.534355	0.536822	99.54
	4	0.10493	500	26.9	0.662955	0.681351	97.30
	5	0.10878	500	27.8	0.682930	0.681351	100.23
	6	0.10502	500	27.1	0.672370	0.681351	98.68
	7	0.10384	500	29.6	0.805040	0.825880	97.47
	8	0.10335	500	29.7	0.813225	0.825880	98.46
	9	0.10401	500	29.7	0.808935	0.825880	97.94