仪器	生产厂家
Antaris Ⅱ傅立叶变换近红外光谱仪	美国Thermo Fisher 公司
1 mm比色皿	Hellma Analytics
TW12数显恒温水浴锅	JULABO
Milli-Q 纯水仪	美国 Millipore 公司
分析天平	梅特勒-托利多有限公司
高压蒸汽灭菌锅	日本Panasonic公司
pH计	梅特勒-托利多仪器有限公司
SHB-III型循环水式多用真空泵	郑州长城科工贸有限公司
移液枪	德国 Eppendorf 股份公司
Matlab 2015b	Mathworks
PLS_Toolbox工具箱	Eigenvector Research
RESULT近红外光谱采集软件	美国Thermo Fisher公司

1.2 试剂
甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司），trypton（胰化胨或称胰蛋白胨，OXOID）、葡萄糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、yeastextract（酵母提取物，OXOID）、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、甘油（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）、乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、去离子水（实验室自制）。
2 方法
2.1 样品的制备
甲醇使用时没有进一步纯化，利用三种不同的培养基配备体积分数为0.1-2.5%（直接稀释），间隔为0.1%的甲醇溶液，共75个样品。
三种培养基如下：
（1）YPD培养基（2）LB培养基（3）YPEG培养基
2.2 光谱的采集
用AntarisⅡ傅里叶变换近红外光谱仪透射模块采集样品光谱，以空气为背景参比，每测一个样本扣除一次背景，随机将样品注入一个光程为1mm的石英比色皿中，利用控温附件将采谱温度控制在30^oC。每个样品采集10张光谱，取其平均作为样品的原始近红外光谱图。
2.3 考察甲醇扰动对水光谱的影响
结合水光谱组学，选择12个适用于低含量甲醇溶液的水基质坐标（water matrixcoordinates，WAMACS）。在甲醇扰动下，利用WAMACS的吸光度作雷达图，观察不同浓度的甲醇水溶液在不同波数下对水光谱的影响。
2.4 定量分析模型的建立
首先对原始光谱进行依次相减法差谱处理，其次利用基于欧氏距离的Kennaed-Stone (KS)法对样品进行校正集和验证集的划分。而后筛选最佳的光谱预处理方法，以提高模型的准确性和有效性。
3 实验结果
3.1 近红外光谱
图3-1为用FT-NIR光谱仪采集得到的25个样品的近红外原始光谱图。从图中可以看出，不同样品光谱的差异性很小，所以需要采用一些化学计量学方法来使不同样品之间的光谱差异放大化

。

图3-1 甲醇-培养基（YPD）溶液样品近红外光谱图（a：原始光谱图；b：差谱图）

3.2 甲醇扰动对水光谱的影响
水的吸收峰较强，容易掩盖住其它扰动对其产生的影响，因此我们必须借助化学计量学手段对光谱进行处理。首先通过依次相减法对样品和溶剂光谱进行差谱之后，再对其进行一阶导数处理，以便突出光谱间的差异。如图3-2所示，从中可以看出，经过差谱和一阶导数处理之后，一些重叠峰显现出来，光谱的分辨能力提高。

图3-2 预处理之后的甲醇-YPD溶液样品近红外光谱图

图3-3 预处理之后7700-6250 cm^-1波段的甲醇-YPD溶液样品近红外光谱图

表3-1 近红外光谱中水的特征峰的归属

序号	波数（cm^-1）	解释	参考文献
1	6400-6200	与甲醇多聚体的数目有关
2	6667	低于这个波数，溶液中氢键增多，水的结构更加稳定
3	6836、6711	（H₂O）_2-3，指含有两、三个氢键的水物种
4	6900	水分子中OH的对称和反对称伸缩振动的组合频
5	6940	（H₂O）₁，指含有一个氢键的水物种
6	7070、6845、6850	水分子中对称和反对称OH伸缩振动的一级组合谱带、甲醇和水形成的环状二聚体
7	7070	（H₂O）₀，不含有氢键的水分子，即自由的水分子
8	7082、6702、6954	弱氢键、强氢键、第三种（受温度影响较大）
9	7149	被称为捕获水的7168和7128 cm^-1之间的是脱水波段

我们选定12个WAMACS用于低含量甲醇的测定，分别为7149 cm^-1、7082 cm^-1、6954 cm^-1、6940 cm^-1、6900 cm^-1、6871 cm^-1、6836 cm^-1、6773 cm^-1、6702 cm^-1、6667 cm^-1、6509 cm^-1和6400 cm^-1。
图3-4为根据低含量的甲醇-YPD溶液在12个WAMACS下的吸光度的差异所做的雷达图。

图3-4 甲醇-YPD溶液雷达图

为了进一步证实所选波数的正确性，我们将具体波数下的吸光度与一级数据进行关联。如表3-2所示，相关系数均大于0.965，说明这12个波数的吸光度与一级数据之间关联度极高，证实了这12个波数的有效性。进一步验证了雷达图用于表征低浓度甲醇溶液的可靠性，说明水光谱组学用于发酵过程可能是一种较好的选择。

表3-2 甲醇-YPD溶液特定波数下的吸光度和一级数据之间的相关性

wavenumber（cm^-1）	correlation coefficient	wavenumber（cm^-1）	correlation coefficient
7149	0.997	6836	0.972
7082	0.967	6773	0.978
6954	0.985	6702	0.985
6940	0.986	6667	0.988
6900	0.979	6509	0.995
6871	0.969	6400	0.976

3.3 定量分析模型的建立
应用KS样品集划分方法，将25份样品按照2:1的比例划分为校正集和验证集，17个校正集样品用于PLSR模型的建立，剩下的8个样品用于模型的预测，PLSR模型用5-倍交叉验证进行检验。
在水的第一倍频区(7600-6250cm^-1)和甲醇的CH₃组合频区(4550-4250cm^-1)两个波段分别建立模型。两个模型的预测结果很相似，证明了可以水为探针对甲醇浓度进行监测，表3-3和表3-4为只对数据进行均值中心化处理时两个模型的预测结果。

表3-3 样本在7600-6250 cm^-1波段模型的预测结果

No.	Reference value (%)	Prediction value(%)	Deviation (%)	Relative deviation(%)
1	0.100	0.156	0.056	56.000
2	0.800	0.865	0.065	8.125
3	1.300	1.341	0.041	3.153
4	1.500	1.523	0.023	1.533
5	1.600	1.652	0.052	3.250
6	1.800	1.868	0.068	3.778
7	2.000	2.018	0.018	0.900
8	2.400	2.414	0.014	0.583

表3-4 样本在4500-4250 cm^-1波段模型的预测结果

No.	Reference value (%)	Prediction value(%)	Deviation (%)	Relative deviation(%)
1	0.100	0.110	0.010	10.000
2	0.800	0.852	0.052	6.500
3	1.300	1.306	0.006	0.462
4	1.500	1.499	-0.001	-0.067
5	1.600	1.627	0.027	1.688
6	1.800	1.804	0.004	0.222
7	2.000	1.996	-0.004	-0.200
8	2.400	2.399	-0.001	0.042

表3-5为水的第一倍频波段的预处理方法优化建模结果，RMSCV值作为模型的评价标准，其值越小说明模型越优。其中导数和SG平滑的点数（3-25点）也经过了优化，如图3-5所示，一阶导数SG平滑的最优点数是13点，过少会使光谱的无效信息滤除的不完全，点数过多会使一些信息有效信息被滤除掉。如图3-6所示，二阶导数SG平滑的最优点数是25点。基于水光谱组学建立的PLSR模型，其最佳预处理方法是二阶导数25点平滑，此时主成分数是4。由图3-7可知，RMSECV随着主成分数的增加而降低，当主成分数选择4时，RMSECV达到最低点，因此，甲醇-YPD溶液中甲醇的定量分析模型的最佳主成分数为4，相关参数(RMSEC、RMSECV、RMSEP、R_c²、R_cv²和R_p²)分别是0.014%，0.038%，0.047%，1.000，0.997，0.999，结果证明近红外光谱技术结合水光谱组学可能为低含量甲醇的测定提供一个新的思路，最佳模型结果如图3-8所示。

图3-5 一阶导数平滑窗口宽度优化结果

图3-6 二阶导数平滑窗口宽度优化结果

表3-5 不同预处理方法下的建模结果比较

预处理方法	模型评价参数
预处理方法	RMSEC	RMSECV	RMSEP	R_c²	R_cv²	R_p²	RPD
autoscaling	0.045	0.052	0.118	0.996	0.995	0.988	6.093
mean center	0.041	0.050	0.123	0.997	0.995	0.988	5.846
SNV^a	0.529	0.657	0.424	0.481	0.339	0.651	1.696
MSC^a	0.530	0.688	0.426	0.479	0.337	0.653	1.688
SG(13,1,1)^{a, b}	0.017	0.044	0.035	0.999	0.996	0.999	20.543
SG(25,2,2)^{a, b}	0.014	0.038	0.047	1.000	0.997	0.999	15.298

a) 预处理之前，对光谱先进行了meancenter处理。
b)SG(a1，a2，a3)：a1是平滑的窗口宽度，a2是多项式次数，a3是导数。

图3-7 主成分数的选择

图3-8 甲醇-YPD溶液最佳定量模型

3.4 其它
利用甲醇-LB溶液和甲醇-YEPG溶液得到的结果均和上述甲醇-YPD溶液得到的结果类似，显示水光谱组学可以用于甲醇-培养基溶液中甲醇含量的测定，为水光谱组学应用于目标物质含量低的毕赤酵母发酵过程奠定了基础。甲醇-LB溶液和甲醇-YEPG溶液的雷达图分别见图3-9和图3-10，不同浓度甲醇溶液在选定的12个WAMACS下的吸光度显示出了差异性。特定波数下的吸光度和一级数据之间的相关性分别见表3-6和表3-7，相关系数均大于0.91，相关度较高，证实了所选WAMACS的正确性。两种培养基溶液的甲醇最佳定量模型分别见3-11和3-12，由表可知RMSE值均很低，R²都大于0.97，说明模型的误差很低，准确度很高。

图3-9 甲醇-LB溶液雷达图（见实验记录0005497-p97）

图3-10 甲醇-YEPG溶液雷达图（见实验记录0005497-p97）

表3-6 甲醇-LB溶液特定波数下的吸光度和一级数据之间的相关性

wavenumber（cm^-1）	correlation coefficient	wavenumber（cm^-1）	correlation coefficient
7149	0.991	6836	0.962
7082	0.969	6773	0.978
6954	0.980	6702	0.984
6940	0.977	6667	0.987
6900	0.964	6509	0.989
6871	0.950	6400	0.964

表3-7 甲醇-YEPG溶液特定波数下的吸光度和一级数据之间的相关性

wavenumber（cm^-1）	correlation coefficient	wavenumber（cm^-1）	correlation coefficient
7149	0.994	6836	0.962
7082	0.968	6773	0.990
6954	0.958	6702	0.993
6940	0.957	6667	0.994
6900	0.935	6509	0.994
6871	0.918	6400	0.991

图3-11 甲醇-LB溶液最佳定量模型

图3-12 甲醇-YEPG溶液最佳定量模型

4 讨论与结论
本章研究中采用AntarisII傅立叶变换近红外光谱仪对水光谱组学在甲醇-培养基（YPD、LB、YEPG）体系中的可行性进行了探究，以便确定其能否用于毕赤酵母发酵过程。首先，实验室条件下直接稀释法配制0.1-2.5%（v/v）甲醇-培养基（YPD、LB、YEPG）溶液，间隔0.1%。其次，利用雷达图选定12个活化的水吸收峰（7149 cm^-1、7082 cm^-1、6954 cm^-1、6940 cm^-1、6900 cm^-1、6871 cm^-1、6836 cm^-1、6773 cm^-1、6702 cm^-1、6667 cm^-1、6509 cm^-1和6400 cm^-1）用于反应甲醇的存在对水光谱的影响，结果显示即使甲醇的变化量是0.1%，仍可以在雷达图中观察到特定波数下吸光度的变化。然后，利用PLSR建立了水光谱组学用于低含量甲醇测定的NIR分析模型，以甲醇-YPD溶液为例，光谱的最佳预处理方法是二阶导数SG25点平滑，最佳主成分数为4，最佳模型的R²_c，R²_cv，R²_p，RMSEC、RMSECV和RMSEP值分别是1.000，0.997，0.999，0.014%，0.038%，0.047%。甲醇-LB培养基溶液和甲醇-YEPG培养基溶液得到的结果和上述甲醇-YPD培养基溶液得到的结果极其相似，结果证明水光谱组学可以用于甲醇含量的测定，为低含量甲醇的测定提供了一个新的视角。
由于样品是在实验室所配的简单体系，距离真正应用于发酵生产中还需要进一步的研究。考虑到实际发酵过程的复杂性，下一步将探讨上述方法在实际动态发酵过程中的应用。

附件：

水光谱组学应用于发酵体系的可行性研究.docx