主题：【第十二届原创】一次川贝母的PCR-RFLP 鉴别能力验证

    小序：市场上贝母类品种较多，相同品种之间的差异性较小，一般人员很容易混淆，2015年版药典规定川贝母的鉴别方法加入PCR测定法，这可以更有效更准确地鉴别川贝母的真伪。
1 仪器与试剂
PCR仪器（赛默飞），分析天平（岛津），纯水仪（密理博），电泳仪（北京市六一仪器厂），干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），全自动凝胶成像系统，水浴锅（北京永光明仪器有限公司），植物基因组提取试剂盒，Taq DNA聚合酶及缓冲液，dNTP Mixture，Sma1限制性内切酶及缓冲液，DNA ladder，GelRed，琼脂糖，引物，对照药材（中检院）。
2 实验方法
2.1 供试品平行取样1份，没份约30mg，按照DNA 提取试剂盒说明书进行操作。
2.2  PCR反应体系的制备
25 μL反应体系：10×PCR缓冲液：2.5 μL；dNTP（10mM）:0.6 μL；引物：上下游引物（20μM）各0.2 μL；Taq DNA聚合酶：0.5 μL；DNA模板：1μL；灭菌超纯水20.0μL；阴性对照为无模板DNA的反应体系。
2.3 PCR扩增：
以4000rpm离心10s后，将PCR管插入PCR仪中，进行如下反应：

2.4 限制性内切酶反应：
2.4.1 酶切反应体系（20μL）；
Sma1 (20U/μL)：0.5μL；10×酶切缓冲液：2μL；PCR产物：10 μL；灭菌超纯水7.5μL；阴性对照为未加PCR产物的反应体系。
2.4.2 酶切反应条件：30℃反应6小时；
2.5 琼脂糖凝胶电泳检测
2.5.1 50×TAE电泳缓冲液的配制：取242 gTris碱，57.1 ml冰醋酸，37.2 g EDTA-Na₂,加入去离子水，充分搅拌溶解，定容至1000 ml，作为贮存液，进行凝胶电泳时稀释50倍成工作液。
2.5.2 1.5%琼脂糖凝胶的制备：称取1.5g琼脂糖，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，微波炉中火加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，冷却至65℃左右加入显色剂GelRed(1:100000)，充分混匀，小心地倒入槽板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拨梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至刚没过胶板为止。
2.5.3 加样：在Parafilm上将μL扩增产物与μL 6×loading buffer混合，用移液器分别将样品加入胶板的样品槽内。
2.5.4 电泳：加样后的凝胶板立即进行电泳，电压5 V/cm，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约2cm处时，停止电泳。
2.5.5 凝胶成像：用凝胶成像系统拍照并保存结果。

小结：PCR测定中，一定要防止试剂污染，假阳性干扰等，注意实验室环境。