主题：【第十二届原创】非洲猪瘟自检实验室仪器设备配置参考

非洲猪瘟自检实验室仪器设备配置参考

我国发生非洲猪瘟疫情后，农业农村部、市场监管总局等单位根据非洲猪瘟疫情态势，连续发布文件，要求屠宰场、猪肉制品加工企业、规模猪场、种猪场开展非洲猪瘟自检。对于如何配置仪器设备，这些屠宰场、猪肉制品加工企业、规模猪场、种猪场可以说是一头雾水。下面谈一些个人看法，供众多自检实验室建设时参考：
一、基本原则
1.满足要求
主管部门对于非洲猪瘟自检的要求非常明确，那就是必须采用PCR检测。
——农业农村部办公厅于2019年1月2日发布的《关于非洲猪瘟病毒检测试剂盒有关事宜的通知》规定：“应急期间，比对符合要求的检测试剂盒（试纸条）可使用至2019年6月30日”。
——2019年1月4日，中国动物疾病预防控制中心公布了通过专家评审的第一经非洲猪瘟现场快速检测试剂名单，共有PCR类和试纸条类。其中规定：PCR类试剂的应用范围为“猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏组织样品快速检测”，试纸条类的应用范围内“仅用于病（死）猪现场快速初步检测”。
——6月11日，中国动物疾病预防控制中心公布了通过专家评审的非洲猪瘟现场快速检测试剂名单，共有荧光定量PCR类和等温扩增类。并规定这两类均适用于猪血液和猪组织样品快速检测。
在农业农村部各类文件中，可以多次见到诸如“规范使用经我部批准或经中国动物疫病预防控制中心比对符合要求的检测方法开展非洲猪瘟检测”的描述，结合非洲猪瘟试剂评审名单，不难看出荧光定量PCR方法是自检实验室的最佳选择。
2.量力而行
作为自检实验室，只要检测的敏感性和特异性能达到要求即可，不必追求高大上。重要的是在满足要求的基础上，量力而行，大型肉联厂等企业，自然可以配置高档次、高通量设备，以满足大批量样品的检测；而小微企业，每天样品只有几个或者十几个，配置低通量设备即可。
3.服务周到
多数相关企业原来并无分子生物学实验室，也没有相关技术人员，在此情况下开展荧光定量PCR试验，如果仪器设备及试剂供应商不提供周到的服务，那结果不言而喻。
4.效果满意
屠宰场、猪肉制品加工企业都是肉品消费的最后一道关口，如果不把握好质量，被非洲猪瘟病毒污染的猪肉及制品，很有可能就会流向市场。因此，尽管这些自检实验室可能因陋就简，但检测效果必须达到要求，不能做样子。
二、仪器设备配置参考
1、试剂及样品保存
本环节涉及的设备主要是冷藏/冷冻箱。
抗凝血采用2℃~8℃保存，推荐药品冷藏箱；猪肉等样品及试剂多采用-20℃保存，推荐低温冰箱。在自检实验室，出于成本考虑，也可采用家用冷藏/冷冻两用冰箱，但应仔细检查，确认冷藏室不会结冰后方能使用。
2、核酸提取
本环节涉及的设备主要是生物安全柜、水浴/金属浴、移液器、离心机、匀浆设备。
按照规定非洲猪瘟核酸提取必须在生物安全柜内操作。进口生物安全柜价格昂贵，每台约需6万元左右。出于成本考虑，可购置国产品牌，但最好能邀请第三方对生物安全柜进行性能测试，合格后再投入检测。净化工作台只能保护样品不受污染，但不能保护操作人员和环境不受污染，因此不推荐购置。
抗凝血或匀浆后的猪肉等样品，应按规定进行灭活后方可进行DNA提取。灭活可采用水浴锅或金属浴，两者效果接近。水浴锅经济实惠，对样品盛放容器（离心管、匀浆管等）适用性广，但需要经常加水，并时常关注水位是否合适；金属浴价格稍高，使用方便，但对样品盛放容器有严格要求。
根据提取试剂盒的不同，使用的移液器有所不同，可能涉及的规格有10μL、50μL、200μL和1000μL。推荐使用进口品牌，精度高、稳定性好；出于成本考虑也可采用国产品牌，但需进行精度和稳定性检查，符合规定方可投入检测。
在进行DNA提取时，离心是必不可少的步骤，一般需要2mL/孔的高速离心机。对于需要洗涤的提取试剂盒，因离心步骤较多，建议购置台式高速离心机，最好是进口产品，其生物安全性高、噪音低、稳定性好。国产高速离心机也可，但应注意购置无刷型，以免噪音过高。对于粗提试剂盒，因步离心步骤不多，可考虑采用微型离心机（掌上型），最好同时配置2mL转子和8联管转子。
在对猪肉等样品进行检测时，还需要先对样品进行匀浆。如果单位时间内猪肉等样品较多，可考虑购置匀浆机，利用钢珠在匀浆管内不断撞击样品，达到匀浆的效果，国产匀浆机目前约3万元左右。对于猪肉等样品很少的单位如规模猪场，可购置玻璃匀浆器进行样品匀浆，价格很便宜，每支约几十元，只是操作比较费时费力。
注：目前自检实验室多采用免提试剂盒，但“免提”不等于“不提”，只是减少了洗涤步骤，实质是粗提。
3、扩增检测
本环节涉及的设备主要有荧光定量PCR仪、移液器、微型离心机。
荧光定量PCR仪直接关系到检测结果的好坏。在选购荧光定量PCR仪时，主要从检测效果、样品孔数、通道数等方面考虑。
对于检测效果，无法直观得到结果，购置前最好参考其他已采购同类设备单位的检测情况，也可在调研时对样机进行效果测试，或在购货合同中约定进行效果测试，不能达到规定检测效果的予以退货处理。对于具体如何测试，后续会有专文进行讲解。
样品孔数要结合单位时间内样品数量、是否需要在规定时间内报告结果来综合考虑，样品量多的可考虑购置96孔或48孔的设备，样品量少的可考虑购置24孔或16孔的设备。屠宰场必须在规定时间内报告结果，否则猪肉及副产品无法出具检疫证，也就不能出场。因此，对于屠宰场，应分析其样品数及每批检测时间，确保在规定时间内能检测完所有样品并报告结果，检测孔数不宜过低如8孔。而对于规模猪场、食品生产企业，对于报告结果的时间就要求不是太严格，可采购孔数稍低的设备。
检测通道数不必过多考虑，对于自检实验室，购置4通道、5通道实属浪费，购置单通道或双通道即可。
移液器前面已有说明，本环节可能需要的2.5μL和10μL移液器，最好采用进口品牌，对检测结果影响较大。
4、实验环境及废弃物处理
本环节涉及的设备主要有紫外消毒车、高压灭菌器等。
实验检测前和检测后，均需对实验台面进行紫外线消毒。推荐购置紫外消毒车，因其移动方便、可定时关机。当然，若因陋就简购置紫外灯管也无不可，但最好能在灯管上方加上灯罩，提高消毒效果。
对于检测后的样品、扩增产物、使用后的手套、口罩等个人防护用品等，按规定均需进行高压灭菌后无害化处理。推荐购置能恒温、定时的自动高压灭菌器，国产品牌的约1万元左右。若购置无恒温功能的高压灭菌器，可购置一台调压器，并反复摸索达到规定温度后维持多少电压才能恒温，并做好记号。以后在开始阶段可将调压器电压调至100%，达到规定后将电压调至维持电压，使用起来也还比较方便。
三、结语
非洲猪瘟自检，对于监管部门和主体企业来说都是一件新鲜事，需要不断摸索。但无论如何，检测效果、防止污染、生物安全都是不容忽视的重要内容，实验室应着重在这几个方面做好工作。