主题：【分享】流动相Ph对液相色谱分析的影响

在用高效液相色谱进行药物分析方法开发的过程中，色谱柱及流动相的种类，添加剂的引入，流动相的pH值调节，温度的控制等等都会对分离选择性产生影响。而其中，色谱柱及流动相的选择往往起着决定性的作用，对于流动相pH的控制，不仅会对色谱柱的稳定性产品影响，并且会对分离的选择性和色谱峰的对称性产生至关重要的作用，尤其是针对某些可以离子化的极性酸碱化合物来说。

一般来说pH对于中性化合物几乎没有什么影响。这是因为一般情况下中性化合物不具备解离能力，因而不会对谱图的分离选择性及峰形的对称性产生影响。对于含有极性官能团的化合物来说，pH会影响化合物的存在状态。进而影响分离选择性及色谱峰的对称性。除此之外，一些做了改性或者Mixed-Mode类型的色谱柱，即便分析物中不含有可电离的物质，但是pH值会影响色谱柱上的官能团状态，进而也会影响到中性化合物的分析。因此在进行方法开发之前，首先要对所选的色谱柱及本身样品所含成份的定性认知。

下图展示的是不同pH对于中性非极性化合物、极性不可解离化合物以及极性可解离化合物的分离选择性的影响。







查阅文献可以看出，当水溶液的pH偏离化合物本身pKa 2个单位以上时，化合物主要以一种形态存在，而当pH在化合物本身pKa 2个范围以内时，化合物以两种形态存在(不解离与解离形态)，而当溶液的pH等于化合物本身的pKa的时候，化合物解离形态与不解离形态大约各占50%，如下图所示。







极性可解离化合物的容量因子与pH之间呈现S型曲线。对于碱性化合物而言，pH越大，其容量因子也越大；对于酸性化合物而言，pH越小，其容量因子也越大，这也是在使用反相HPLC“酸加酸，碱加碱”的原因，其目的在于抑制酸碱极性化合物的离子化作用，增强与C18固定相之间的相互作用，而提高该类化合物的保留时间。同时需要注意的是：在进行方法开发的时候，尽量选取酸的高保留平台去和碱的高保留平台区，如果在中间斜率比较大区域，在pH值稍微有些变化的时候就会对峰形、保留时间、分离度有很大影响。







PH的大小影响到极性可解离化合物以及色谱柱硅羟基的解离程度，离子化的分析物在典型的ODS反相色谱柱上往往会出现拖尾现象。通过改变流动相的pH，抑制其解离，可改变极性可解离化合物的容量因子，改变其出峰位置，提高分离的选择性，且提高色谱峰的对称性。此外，有机相的添加会使得流动相的pH以及待分析化合物的pKa发生改变，因此在调节流动相pH的时候，最好将此部分也考虑进去。