第一次接到铁皮石斛样品的时候我还在论坛求助，确实这个药材相对其他品种属于不好做的，很多论坛都有说跑不出来，下面根据自己做的情况分享一下注意事项。

1 实验材料与设备
1.1 材料
铁皮石斛药材（送检样）；乙腈（色谱级），无水乙醇（分析纯）；甘露糖、葡萄糖、盐酸氨基葡萄糖（购自中检院），乙酸铵，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，氢氧化钠，盐酸，三氯甲烷。岛津液相LC-20AT配制DAD检测器，安家Eclipse XDB C18 色谱柱(250mm*4.6μm*5μm)，恒温水浴锅。

1.2 色谱条件

流动相（参照中国药典2015年第一部）：乙腈-0.02mol/L乙酸铵（20 :80)为流动相；检测波长250 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0mL/min，进样量：10μL。

2 实验步骤（参照2020药典第一部铁皮石斛项下）

2.1 校正因子

取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，配制成浓度为12mg/mL，作为内标溶液。另取甘露糖对照品约10mg，精密称定，精密加人内标溶液l mL，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制浓度为0.1mg/mL，吸取 0.4 ml，加入0.5mol/L的 PMP (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液与0. 3mol/L的氢氧化钠溶液各0.4 ml，混匀，70℃水浴反应100分钟。再加0. 3mol/L的盐酸溶液0.5mL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入液相色谱仪待测，计算校正因子。

校正因子公式：f_i=(A_内标/m_内标)/(A_甘露糖/m_甘露糖）

A峰面积，m为加入内标物和对照品的量

图1 盐酸氨基葡萄糖色谱图（12.030min 盐酸氨基葡萄糖色谱峰 10.514min PMP色谱峰）

图2 甘露糖标品色谱图（9.289min 甘露糖色谱峰，11.876min 盐酸氨基葡萄糖色谱峰 10.532min PMP色谱峰）

2.2 甘露糖与葡萄糖峰面积比

取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成浓度为50 μg/mL ，作为对照品溶液。精密吸取0. 4mL，加入0.5mol/L的 PMP (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液与0. 3mol/L的氢氧化钠溶液各0.4mL，混匀，70℃水浴反应100分钟。再加0. 3mol/L的盐酸溶液0.5mL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入液相色谱仪待测。计算甘露糖与葡萄糖的峰面积比。

图4 葡萄糖标品色谱图（19.411min 葡萄糖）

2.3甘露糖含量

本品粉末（过三号筛）约0. 12g，精密称定，置索氏提取器中，加80%乙醇适量，加热回流提取4小时，弃去乙醇液，药淹挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100mL，再精密加入内标溶液2ml，煎煮小时并时时搅拌，放冷，加水补至约100mL，混勻，离心，吸取上清液1ml，置安瓿瓶或顶空瓶中，加3. 0 mol/L的盐酸溶液0.5mL，封口，混匀，110℃水解1小时，放冷，用3. 0 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，吸取 0.4mL，加入0.5mol/L的 PMP (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液与0. 3mol/L的氢氧化钠溶液各0.4 ml，混匀，70℃水浴反应100分钟。再加0. 3mol/L的盐酸溶液0.5mL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，过0.45μm滤膜，注入液相色谱仪待测。