微生物法测定原理：

泛酸是植物乳杆菌生长所必需的营养素,在一定控制条件下,将植物乳杆菌液接种至含有试样液的培养液中,培养一定时间后测定透光率(或吸光度值),根据泛酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中泛酸的含量。

1.试管处理

所用试管使用前洗刷干净,用水煮沸 30min ,沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡 2h ,经 170℃ 烘 3h 后使用。

2.试液配制

乙酸溶液( 0. 2mol/ L ):吸取 11.8mL 冰乙酸,用水稀释至 1000mL ,混匀。

乙酸钠溶液( 0. 2mol/ L ):称取 27.2g 三水合乙酸钠,加水溶解并稀释至1000mL，混匀。

氢氧化钠溶液( 1mol/ L ):称取 40g 氢氧化钠,加水溶解并稀释至 1000mL ,混匀氢氧化钠溶液( 0.1mol/ L ):称取 4g 氢氧化钠,加水溶解并稀释至 1000mL ,混匀。

生理盐水:称取 9g 氯化钠,加水溶解并稀释至 1000mL ,混匀。临用前预先灭菌,于 121℃ 高压灭菌 10min 后备用。

乙醇溶液( 20% ):量取 200mL 无水乙醇与 800mL 水混匀。

3.标准溶液的配制

泛酸标准储备溶液( 40. 0 μ g / mL ):精确称取 43. 5mg 预干燥至恒重的 D- 泛酸钙,加水溶解并转移至 1000mL 容量瓶中,加 10mL 乙酸溶液, 100mL 乙酸钠溶液,用水定容至刻度。储存于棕色瓶中,加入 3 滴 ~5 滴甲苯,于 2℃~4℃ 冰箱中可保存 2 年。

泛酸标准中间液( 1. 00 μ g / mL ):准确吸取 25. 0mL 泛酸标准储备溶液置于 1000mL 容量瓶中,加入 10mL 乙酸溶液,100mL 乙酸钠溶液,用水定容至刻度。加入 3 滴 ~5 滴甲苯于 2℃~4℃ 冰箱中可保存 1 年。

泛酸标准工作溶液( 20ng / mL ):准确吸取 2. 00mL 泛酸标准中间溶液置于 100mL 容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。临用前现配。

4.储备菌种的制备

将菌种植物乳杆菌转接至琼脂培养基中,在 37℃±1℃ 恒温箱中培养 20h~24h ,连续传种 2 次 ~3 次。取出后放入 2℃~4℃ 冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代一次,不宜超过 25 代。试验前将储备菌株接种至琼脂培养基中,37℃±1℃ 恒温培养箱中培养 20h~24h 以活化菌株,用于接种液的制备。
注:保存数周以上的储备菌株,不能立即用作接种液制备,试验前宜连续传种 2 代 ~3 代以保证细菌活力。

5.接种液的制备
试验前一天,取 2mL 泛酸标准工作溶液和 4mL 泛酸测定用培养液混匀,分装于 2 支 5mL 离心管中,塞好棉塞,于121℃ 高压灭菌 10min 后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至2 支种子培养液中,于 37℃±1℃ 恒温培养箱中培养 20h~24h 。

取出后 3000r / min 离心 10min ,弃上清液,无菌操作下用已预先灭菌的生理盐水淋洗 2 次, 3000r / min 离心 10min ,弃上清液。再加入3mL 灭菌生理盐水,振荡混匀,制成接种液,立即使用。

8.标准系列管：

泛酸标准工作溶液/mL	0	0.5	1	1.5	2.0	2.5	3	3.5	4	4.5	5
加水量/mL	5	4.5	4	3.5	3	2.5	2	1.5	1	0.5	0
泛酸测定用培养基/mL	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5

9.灭菌：
将所有测定管塞好棉塞,于 121℃ 高压灭菌 10min 。

接种和培养：待测定系列管冷却至室温后,在无菌操作条件下向每支测定管滴加接种液 50 μ L 。塞好塞子,置于37℃±1℃ 恒温培养箱中培养 16h~20h ,直至达到最大混浊度,即再培养 2h 后透光率(或吸光度值)无明显变化。另准备一支标准 0 管(含 0ng 泛酸)不接种作为 0 对照管。

测定：将培养好的标准系列管、试样管用漩涡混匀器混匀。用厚度为 1cm 比色杯,于550nm 处,以未接种的 0对照管调节吸光度值为 0,依次测定标准系列管、试样管的吸光度值。

如果0 对照管有明显的细菌增长,或者与0对照管相比,标准0管透光率在 90% 以下(或吸光度值在 0.2 以上);或标准系列管透光率最大变化量 <40% (或吸光度值变化量 <0.4 ,说明可能有杂菌或不明来源的泛酸混入,需重做试验。

10.标准曲线
以标准系列管泛酸含量为横坐标,每个标准点透光率(或吸光度值)均值为纵坐标,绘制标准曲线。

11.试样结果计算
从标准曲线查得试样管中泛酸的相应含量(ρx ),如果每个试样的4 支试样系列管中有 3 支以上泛酸含量10ng~80ng范围内,且计算每毫升试样稀释液中泛酸浓度(ρ),各管之间相对偏差小于 15% ,则可继续进行结果计算,否则需重新取样测定。

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主题：【第十六届原创】乳制品微生物法检验泛酸过程及注意事项