主题：【分享】龙胆草中香叶醇10-羟化酶基因的克隆、蛋白结构及表达分析

龙胆苦苷(gentiopicroside)是龙胆、秦艽、当药、獐牙菜等龙胆属植物的活性成分之一。从结构上来看，龙胆苦苷属于裂环烯醚萜类化合物，由环烯醚萜苷的母核环戊烷C7-C8键断裂衍生而成。龙胆苦苷具有抗炎镇痛，保肝，抗氧化，抗病原微生物等多种药理活性，临床应用价值广泛。研究表明龙胆苦苷主要在龙胆属植物的叶片中合成，经过茎，最后运输到根部储藏。目前从药用植物中直接提取龙胆苦苷的方法受到提取效率低，含量低、资源匮乏(龙胆作为III级保护植物物种收录于《国家重点保护野生药材物种名录》中)等多种因素限制，而化学合成法涉及到活性基团的保护与去保护，程序繁琐，不易大规模工业化制备，且环境不友好。相比之下，酶法合成的方式绿色高效且专一性强，为龙胆苦苷的快速获得提供了新的思路。因此，深入解析并挖掘龙胆苦苷生物合成途径中涉及到的相关基因并对其进行功能验证已成为了目前研究的热点。作为一类特殊的单萜，龙胆苦苷的生物合成途径也遵循萜类化合物的一般合成规律，主要分为前体物质合成、萜类骨架形成以及后修饰三个阶段。第一阶段通过甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)途径和2-甲基-赤藓醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径生成前体物质二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)。第二阶段以牻牛儿基二磷酸(Geranyl diphosphate,GPP)为前体，经过脱磷酸化反应生成环烯醚萜类化合物生物合成途径的重要组分香叶醇(geraniol)，该化合物后续在多种酶例如香叶醇10-羟化酶(geraniol 10-hydroxylase,G10H)、香叶醇-10羟基氧化还原酶(10-hydroxygeraniol oxidoreductase,10-HGO)、环烯醚萜合酶(iridoid synthase,IS)、7-脱氧马钱苷酸葡萄糖基转移酶(7-deoxyloganetic acid glucosyl transferase,7-DLGT)、7-脱氧番木鳖酸-7-羟化酶(7-deoxyloganin 7-hydroxylase,7-DLH)及裂环番木鳖酸合成酶(secologanin synthase,SLS)的作用下经过氧化、还原、甲基化、糖基化等反应生成关键中间体裂环番木鳖苷。目前，基于转录组测序技术的发展，龙胆苦苷生物合成途径的第一、二阶段已经相对清楚。但是经由裂环番木鳖苷生成龙胆苦苷第三阶段的相关酶和多个关键步骤还未被揭示。

在龙胆苦苷的生物合成途径中，香叶醇(geraniol)的氧化被认为是第一个关键限速步骤(见图1)。此反应由香叶醇10-羟化酶(geraniol 10-hydroxylase,G10H)催化香叶醇在C-10位羟基化，生成重要的中间产物10-羟基香叶醇(10-hydroxygeraniol)。该酶属于细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase)家族中CYP76B亚家族的成员，在发挥催化作用时需NADPH的辅助。目前可从广藿香、长春花、川西獐牙菜、秦艽、蜘蛛香等少数植物中克隆得到。已有的研究表明提高香叶醇10-羟化酶基因在蜘蛛香、川西獐芽菜等植物中的表达量可促进包括獐芽菜苦苷等环烯醚萜类成分的积累，除此之外，该基因在长春花萜类吲哚生物碱合成上游途径中也起着关键调控作用。因此，深入解析G10H发挥催化作用的机理有助于为阐明包括龙胆苦苷在内的环烯醚萜类化合物的生物合成途径解析奠定基础。