摘要：目的：本文采用反相高效液相色谱法建立测定果冻类食品叶酸（folic acid）含量的分析的方法。方法：使用C₁₈柱作为分析柱，磷酸缓冲液和甲醇作为流动相，紫外检测器作为检测器，叶酸（Pteroylmonoglutamic acid）作为对照品，果冻食品作为样品。结论：该法在50ng/mL-1000ng/mL之间呈良好的线性，重现性好RSD＜2%，回收率在107±2%，稳定性良好，最小检测限20ng/mL。样品测试结果与微生物检测结果相符。本法可以作为测定食品中叶酸含量的一个方法。

关键词：叶酸，HP$$lc，果冻样品
Abstracts ：Aim: A simple method for the determination offolic acid in gel sample by high-performance liquid chromatography withUV-detection is reported. Methods: The method was simple by using RP-column (C₁₈)with phosphorate -methanol as mobile phase and UV as a detector. Conclusion: The calibration graph was linear from 50 to1000ng/mL for folic acid with a correlation coefficient of 0.999(n=5). Thedetection limit is 20ng/mL. The method was successfully applied fordetermination of folic acid in the gel sample. The recovery was 107±1.5% and the reletive standard deviation was no morethan 2%. Compared with microbiology method, the results of the samples are same.This method can be used for content determination of the folic acid in gelsample.
Key Words: folic acid, HP$$lc, gel sample

1.前言与文献综述
1.1叶酸的理化性质，生物学功能
叶酸(folic acid)是一组含有碟酰谷氨酸结构的一类化合物统称。食物中的叶酸绝大多数是以喋酰多谷氨酸(或称多谷氨酸叶酸)的形式存在的。叶酸为淡黄色结晶粉末，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚及其它有机溶剂；叶酸的钠盐易溶于水，但在水溶液中易被光解破坏，分解成碟啶和氨基苯甲酰谷氨酸盐。在酸性溶液中对热不稳定，而在中性和碱性溶液中却十分稳定。食品中叶酸经受热易损失。
食物叶酸经小肠粘膜细胞内特异叶酰多谷氨酸水解酶的作用，水解为喋酰单谷氨酸(或称单谷氨酸叶酸，PteGlu①)后吸收。吸收后的单谷氨酸叶酸一部分又转变为多谷氨酸叶酸，在肝脏、红细胞及其他组织细胞内贮存，其余部分则以单谷氨酸叶酸的形式分布于血浆、组织液、胆汁及尿液中。肝脏的叶酸浓度是血浆的几百倍，但其单谷氨酸叶酸浓度与血浆相近。叶酸以8种辅酶形式存在于生物体内，为一碳单位的载体参与嘌呤、嘧啶等重要物质的合成。因此叶酸在DNA、RNA、核酸和蛋白质的生物合成中起着重要作用，是细胞增殖和机体发育的物质基础。叶酸在体内的含量直接影响到多种物质如核苷酸的代谢，进而影响血细胞的形成。
1.2目前测定叶酸的一些主要方法以及对各个方法的评价
1.2.1微生物法
微生物法是检测生物体内叶酸的经典方法。它最根本的原理在于利用了微生物对于某些营养物质的特异性。大量的研究发现，某种微生物会对某种维生素具有极强的特异性，是其正常生长所必需的维生素，并且在一定条件下，其生长与繁殖速度与溶液中该维生素的含量成一定的对应关系，含量高则生长快，反之则慢，微生物法便利用了这种对应关系间接地测定出样品中该维生素的含量。通常所用的微生物有干酪样乳酸杆菌（L.casei）、粪链球菌和啤酒小球菌属。此3种微生物对不同形式叶酸的敏感度不同。粪链球菌只对非甲基化叶酸敏感，如PteGlu、二氢叶酸(DHF)和四氢叶酸(THF)。
微生物分析叶酸具有极高的灵敏度准确度高、先期投入少，见效快、测定结果反映了样品中具有生物活性的被测物含量等优点。许多国际标准方法机构仍旧将微生物法作为叶酸分析的标准方法或第一方法。
但是微生物法也有许多局限性，如整个实验周期长，批间检测结果重复性差，检测结果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响，只能反映维生素的总含量，不能测定维生素各种异构体的组成和含量等。
1.2.2同位素放射免疫法
同位素放射免疫法检测血清叶酸始于70年代初。该方法具有快速、简便的特点，同时由于叶酸放射免疫试剂盒的出现，很快得到普及，尤其广泛应用于临床实验室。
放射免疫法与微生物法检测叶酸，除原理不同外，检测结果的意义也有所不同。对大量标本总体而言，两种方法结果相关性较好，但对个体标本，两种方法结果的差异较大。微生物法对多谷氨酸叶酸响应值低，不能直接用于检测叶酸含量。但微生物法对所有单谷氨酸叶酸及其衍生物的反应灵敏度相同，故在用叶酸水解酶处理样品使所有叶酸形式转变为单谷氨酸叶酸后进行检测，可得到准确的叶酸值。同位素放射免疫法对多谷氨酸叶酸反应的相对灵敏度有较大的差别，随着叶酸浓度增加，反应的相对灵敏度增加，但多谷氨酸叶酸的反应曲线不可能与单谷氨酸叶酸的反应曲线重合；另一方面，多谷氨酸叶酸与结合蛋白的亲合性与单谷氨酸叶酸相比较高，不同的单谷氨酸叶酸衍生物反应灵敏度不同，放射免疫法也不适用于检测单谷氨酸叶酸衍生混合物。由于上述原因，尽管放射免疫法可用于检测和评价叶酸的营养状况，但从定量检测的角度来讲，难以得到准确的叶酸含量值。
1.2.3离子捕获法
Wilson等提出离子捕获法检测叶酸，该技术可谓叶酸检测技术中的最新方法，即在实验中，样品加入变性剂后叶酸与内源性结合蛋白分离，释放后的叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合，最后通过碱性磷酸酶与喋酸(叶酸的类似物)结合物对叶酸结合蛋白上游离结合位点的探查，定量分析样品的叶酸含量。该研究证实，离子捕获法测定血清或红细胞叶酸，其结果与同位素放射免疫法的结果具有良好的相关性，相关系数分别为0.96 和0.93。
1.3色谱法和HP$$lc法在测定食品中叶酸含量的现状

色谱法也称层析法，是一种分配平衡为基础的分离分析技术。色谱分离体系包含两相：固定相和流动相。由流动相带领的物质分子在固定相间分配达到“平衡”的过程。通过不同物质分配平衡性质的差异达到彼此分离。

20世纪70年代初发展起来的高效液相色谱（High performance liquidchromatography, HP$$lc）吸收了普通液相层析和气相色谱的优点，经过适当改进发展起来的。它既有普通液相层析的功能（可在常温下分离制备水溶性物质），又有气相色谱诸多优点（高速、高分辨率和高灵敏度）。适用于很多不易挥发、受热易分解的物质定性定量分析。

运用高效液相色谱（HP$$lc）方法来定量食品中叶酸含量在近年来得到了普及。借助于色谱柱的高分离效果和灵敏的检测器，有能力来分离检测不同形式叶酸。中国药典方法使用高效液相色谱－紫外检测器检测叶酸。由于有些叶酸具有荧光特性，D.MP.Johan等使用高效液相色谱－荧光－紫外检测器的串连（HP$$lc-FD-UV）分析面包酵母中叶酸含量。R.Stefania等同样使用HP$$lc-FD-UV分析意大利食品中叶酸含量。由于食品中的干扰物质多，且叶酸含量较少，E.J.M.Konings 使用固相萃取法（SPE）对样品进行纯化和富集，然后使用HP$$lc-FD-UV检测牛奶，肝脏，蔬菜，面粉中的叶酸。L.H Douglas 等用HP$$lc-柱前衍生和HP$$lc-电化学检测器分别检测牛奶和其它食品中叶酸含量。随着技术的进步，高效液相色谱和质谱联用（HP$$lc-MS）提供了专一性好，灵敏的方法。A.Freisleben使用$$lc-FD-MS联用检测食品中叶酸含量。

表一：几种液相色谱联用的检测器方法的比较：

Table 1. Comparison of some detectors of HP$$lc

检测器	原理	灵敏度	专一性	检测限②	评注
紫外 (UV)	物质在紫外光谱有吸收	较高	稍强	2μg/100mL	受到食品中其它物质干扰较大。

荧光 (FD)	共轭结构在激发光下电子激发到高能态，退激回基态时能量以荧光形式释放，根据荧光强度得待测物浓度。	高	强	不能检测	能检测四氢叶酸和5－甲基四氢叶酸。而叶酸（Pt-Glu）③无荧光性质。

电化学(ECD)	外加电压使特征物质失去电子，根据失去电子形成电流大小得出待测物质的浓度。	高	强	0.32pmol	灵敏度高，专一性强。但是装备复杂。

质谱 (MS)	特征碎片离子检测	较高	强	0.1μg/100mL	不普及，价格高。但是发展方向。

1.4方法学建立的目的和意义以及技术路线
1.4.1方法学建立的目的和意义
由于人体内的叶酸几乎完全依赖于食物的摄入，因此当摄入量不足或利用率低时，体内便会出现叶酸缺乏的状况。近年来的研究表明，叶酸缺乏会导致贫血、慢性下痢、食欲不振、发育迟缓等疾病，孕妇补充叶酸可防止因神经系统发育不全而形成的畸胎，儿童服用叶酸可提高智商，促进智力发展。所以，叶酸强化食品的摄取对人类健康具有重要意义。而叶酸强化食品的含量的科学性显得十分重要。
确实食品添加剂的质和量决定着加工类食品的营养和安全性。国外对于食品营养和安全十分关注，通过在加工食品的包装上注明的添加成分、营养物质的含量、适宜人群在产品包装，以利于不同需求的消费者选择。随着国内外交流的加强和HACCP认证的推进以及质量意识的增强，食品安全，食品营养受到了消费者和食品生产企业的关注。随着分析测试仪器的先进化和自动化给食品中各个成分的测定提供了强有力的“武器”，尤其是高效液相色谱的普及，它的高效性、准确性、方便、微量等优点是食品分析的一场“革命”。国内外HP$$lc法测定食品营养成份和食品添加剂方法发展得很快，相关报道较多。但是由于叶酸在食品中添加量甚微，食品中干扰物质较多，所以相应的文章报道相对较少。基于以上考虑设立本项目，具体目的有以下四点：

建立高效液相色谱方法分离分析果冻类样品中叶酸含量的方法学；
通过色谱条件的摸索和优化，获得叶酸分离的最佳条件；
对样品前处理条件的摸索和调整，得到简便、快速、有效的样品前处理方法；
通过对本套方法学的验证包括线性、精密度、回收率、稳定性等实验，建立可靠、完善、准确的测定果冻类样品中叶酸含量的方法学。
本方法的建立，可为检测果冻类样品中叶酸含量提供可靠和准确的手段，也为检测其他食品中叶酸含量提供参考资料，所以本研究具有社会效益和经济价值。

1.4.2技术路线
色谱条件的建立（流动相配比、色谱柱选取、检测波长、流速、柱温） [img=,51,13][/img] 积分条件的建立 [img=,51,14][/img] 确立标准品、样品配制方法 [img=,51,13][/img] 方法学验证（线性回归、精密度、回收率、稳定性、样品含量测定）[img=,40,14][/img] 方法学的改进

2.实验部分
2.1实验样品的描述
2.1.1样品性质
无色或淡黄色果胶类样品。常温下为胶态和液态混合物。样品名称（AminoVital Supersports；AminoVital-1；AminoVital-2）。
2.1.2样品中添加的主要物质
添加氨基酸，维生素类，甜味剂，食用香精，食用色素，有机酸。
2.1.3可能的干扰因素
根据配料表信息，氨基酸、甜味剂、色素等物质在样品中较维生素几十倍量添加，而维生素中又以维生素C添加量最大，叶酸添加量相当少。所以上述物质对叶酸分析造成较大的干扰。
2.1.4标准品和样品保存条件
标准品避光保存于冰箱冷冻柜中。样品置于-18℃冷藏库中保存。
2.2实验条件
2.2.1仪器和试剂及标准品
仪器配置：岛津$$lc-10A系列
泵：$$lc-10ADVP
真空脱气机：DGU-12A
控制器：SCL-10AVP
紫外检测器：SPD-10AVP
自动进样器：SIL-10ADVP
柱温箱：CTO-10ASVP
积分仪：CR-8A和$$lc-Solution积分工作站
试剂：磷酸二氢钾（GR），氢氧化钾（GR），甲醇（HP$$lc），氨水（GR），纯水（HP$$lc）
标准品：叶酸标准品（Pteroylglutamic Acid），纯度：98.0～102.0％和光特级
2.2.2HP$$lc方法条件建立
2.2.2.1流动相配制
0.05mol/L磷酸二氢钾（pH=6.33）：甲醇＝92：8（体积比），作为流动相。
称取7.0g KH₂PO₄置于1000mL烧杯，加入800mL纯水，溶解。通过滴加0.1mol/L KOH溶液，调节缓冲液pH值为6.33，转移至1000mL容量瓶中，加入80mL甲醇，再用纯水定容至刻度，摇匀。用0.45μm微孔滤膜过滤。装瓶。
2.2.2.2检测器和检测波长
使用紫外检测器。使用λ＝285nm作为检测波长。
2.2.2.3色谱柱
ODS柱作为本次实验的分离分析柱。
2.2.2.4流速和柱温选
流速设0.6mL/min；柱温选定为35.0℃
2.2.2.5色谱条件：
色谱柱：Shim-pack VP-ODS 4.6mm×150mm 粒度：5μm (P/N 228-34937-91)
流速：0.6mL/min
检测器：紫外检测器
波长：λ＝285nm
进样量：100μL
分析时间：100分钟（对于标准品测试仅需40分钟）
柱温：35.0 ℃

2.3标准品配制（线性浓度配制）
标准品在使用前先放置于五氧化二磷干燥器至室温，并且避光保存。称取5.1mg叶酸（Pteroylglutamic Acid, 纯度：98.0～102.0％和光特级）标准品，置于50mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶液稀释，定容，摇匀。作为贮备液。
用移液管吸取叶酸贮备液1mL，移入100mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶液稀释，定容，摇匀。浓度为1020ng/mL.（STD 5）。
分别吸取STD 5溶液1mL, 1mL, 5mL, 5mL, 置于20mL, 10mL, 25mL, 10mL容量瓶中，用0.5％氨水溶液稀释，定容，摇匀。浓度分别为 51ng/mL.（STD 1）；102ng/mL.（STD 2）；204ng/mL.（STD 3）；510ng/mL.（STD 4）。

表二：标准品及对应的浓度

Table 2．Standard and their concentrations

标准品			浓度(ng/mL)
STD1			51
STD2			102
STD3			204
STD4			510
STD5			1020

2.4精密度重复性
5个标准均连续进样6次，测试标准品相对标准偏差。
2.5标准品稳定性
5℃保存的半个月的叶酸标准品贮备液，放至室温。用移液管吸取1mL移入100mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水定容，摇匀。
再用移液管吸取上述溶液，移入10mL棕色容量瓶中。用0.5％氨水定容，摇匀。连同新试验配制的同浓度标准品一起测试。观察叶酸标准品在0.5％氨水溶液中的稳定性。

2.6样品前处理步骤
精密称取样品5.00g置于25mL棕色容量瓶中，用0.5%氨水溶解，定容，摇匀。超声波超声10分钟。10000rpm离心10分钟。取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤。作为检液。
2.7样品配制
每个样品测试3次，样品分析后，在各样品中添加1mL STD5标准品，来确定样品溶液中叶酸的保留时间。样品分析时间100分钟。
2.8样品回收率
样品名称：Amino Vital ATP 19582
精密称取样品5.00g，置于25mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶解，定容，摇匀。10000rpm离心10分钟。吸取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤。作为空白检液。
精密称取10.00g样品，置于50mL棕色容量瓶中，用移液管吸取5mLSTD 5 溶液，移入同一容量瓶中，用0.5％氨水溶解，定容，摇匀。10000rpm离心10分钟。吸取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤。作为回收率试验检液。
2.9确定最小检测浓度
用移液管吸取STD3标准品1mL置于10mL棕色容量瓶中，用0.5％氨水溶解，定容，摇匀。浓度为20ng/mL.
3.结论
3.1标准曲线

表三：标准品浓度和峰面积

Table 3.Standard concentration with their peak area

C(ng/mL)			平均面积
51			16661
102			33061
204			66948
510			168852
1020			331618

[img=,547,246][/img]

图一：叶酸标准品浓度和面积线性关系图

Fig1.Linearity of HP$$lc method

叶酸标准品线性回归方程： Y＝325.58x+555.10 R=0.9999
式中Y是面积；x是浓度；R是相关系数。
[img=,553,174][/img]

图二：204ng/mL叶酸标准品色谱图

Fig 2.Chromatogram of folic acid standard (204g/mL)

3.2精密度
每个标准品重复测试6次，各相对标准偏差见表四：

表四：叶酸标准品精密度测试数据

Table4.Percise of standards

C(ng/mL)			RSD%
51			1.13%
102			1.20%
204			1.53%
510			0.22%
1020			0.34%

3.3样品测试结果
表五：HP$$lc方法测定的果冻类样品中叶酸含量
Table 5. Folic acid content in gel samples(μg/100g) by HP$$lc

样品名 HP$$lc测定量(μg/100g)

1.Amino Vital 31.7
Supersports
2. Amino Vital-1 17.6
3.Amino Vital-2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 17.9

3.4 回收率
样品名：Amino Vital 　ATP 19582

表六：添加回收率测定
Table 6. Recoveries of folic acid to sample

Amino Vital 回收率

1． 106％
2 107%
3． 109％

平均回收率为107±1.5％

[img=,528,162][/img]

图三：回收率测试空白图谱（Amino Vital ATP 19582）

Fig 3.Recovery test chromatogram Blank(Amino Vital )

[img=,528,164][/img]

图四：回收率测试添加叶酸标准溶液图谱（Amino Vital ）

Fig 4.Recovery test chromatogram by adding folic acid standardsolution(Amino Vital )

3.5 HP$$lc法与微生物法测试结果比较
日本的国家标准是使用微生物方法测定叶酸的含量。微生物方法测定的是食品中总的叶酸含量，应该比HP$$lc方法测的的值要大些。
为了比较HP$$lc方法的准确性，通过对应样品比较得知。
表七：微生物测定值与HP$$lc测定值比较
Table 7. Comparison of the result of mircobiology
method and HP$$lc method

样品名微生物测定值(μg/100g) HP$$lc测定值(μg/100g)

1.Amino Vital 44 31.7
Super sports
2. Amino Vital 18 17.6

3.Amino Vital　　　　　　　　　20　　　　　　　　　17.9

3.6总体评价及方法适应性
通过以上实验以及对实验数据的分析和比较，得出本方法线性拟合良好，精密度高，最小检测限低。样品添加回收率在107±2％内，并且样品测试结果与微生物方法测试结果作比较，两者数据相近。本方法简便，前处理相对简便，可以为检测果冻类样品中叶酸含量提供可靠和准确的分析手段，同时也为其它食品中叶酸含量的检测提供参考。
4.讨论
4.1分析条件选取
4.1.1流动相
流动相在HP$$lc分离分析中起着至关重要的作用。
过实验确定了本次实验的流动相。原因如下：

叶酸在碱性水溶液中溶解且稳定性较好，而大多数ODS柱在pH=2.0～7.0范围内使用，所以本文使用的流动相pH值在6.3比较适合
通过实验发现水相和甲醇的配比为92：8（v/v）分离效果最好。样品中叶酸和前面的杂质完全分离。
使用磷酸二氢钾和氢氧化钾来调节离子浓度和pH值。这时色谱峰形呈正态曲线，柱效最高。

4.1.2检测器和检测波长
叶酸中有苯环和碟酰结构，图五。所以可以用紫外检测器来检测。虽然叶酸中有共轭结构，但是通过实验发现Pteroylglutamic Acid 无荧光吸收。所以不能使用荧光检测器。
由于条件限制，无全波长扫描的紫外光度计和二极管阵列检测器。所以通过文献和实验来找最佳波长。
根据报道，叶酸在265nm，285nm至290nm以及365nm处有极大吸收。在265nm，285nm，290nm，365nm分析同一叶酸标准品，发现λ＝285nm处峰形最高。

[img=,363,124][/img]

图五：叶酸的分子结构

Fig 5. Molecular structure of folicacid (Pteroylglutamic Acid)

4.1.3 进样量
所以根据本实验室条件，100μL的进样量适合并且满足实验要求。
4.1.4分析时间
由于标准品在30分钟内就已出来，所以标准品采集时间仅需30分钟。但是样品中成分复杂，一定把样品中组分全部出尽才能进下一个样品。通过实验样品的采集时间为100分钟。
4.2试样标准的配制讨论
4.2.1样品试液选取
原则：确保叶酸在溶液中溶解且不被破坏。
实验证明：叶酸不溶解于纯水中，在酸性溶液中不稳定。而使用0.5％氨水溶液较好地溶解叶酸，而且通过稳定性实验，叶酸在该试液中稳定，峰面积无显著变化。
4.2.2标准品浓度选取
本实验样品的浓度恰好在线性范围内，而且标准品浓度与响应值呈一元线性关系。
4.2.3样品前处理
样品使用0.5％氨水溶液溶解。由于样品呈液胶状，超声波超声可以击碎胶状物质，使其分散。通过实验发现10分钟超声可以使之形成均一、稳定的溶液。
5.后续工作及前景
由于条件的限制和目的要求的局限，本文只对一种叶酸化合物进行分析测试，而食品中的叶酸形式有五种之多。通过流动相摸索和梯度洗脱完全能够使不同形式的叶酸得到分离，以此扩大分析的范围。同时叶酸分析也可以通过色谱条件的摸索与其它物质（尤其是水溶性维生素）一起分析，达到提高效率的目的。
为了使灵敏度提高，高效能的检测器的选择有着可观的前景。现在困扰我们分析叶酸含量的主要问题是样品中叶酸含量甚微，仅仅是ng级。紫外检测器最小检测限也就是这个级别。本文也指出：一味地扩大样品称样量或增加样品进样量会导致噪音增大，同样不能提高灵敏度。所以象一些专属性较强的检测器如荧光检测器，电化学检测器是考虑的一个方向。荧光检测器的灵敏度可以达到pg级。对于荧光检测器不能检测Pteroylglutamic Acid，是由于该物质没有荧光发色基团。我们可以通过柱前或柱后衍生的方法让其接上荧光发色基团，或者是柱前分离柱后通过反应液改变它的结构，提高检测的灵敏度。而使用电化学检测器需要摸索诸如电离电压，流动相等等条件。由于电化学检测器它的专属性很高，不容易受到干扰物质的影响。它应该是一个发展方向。
从样品前处理的角度考虑，前处理步骤越少，分析时间更短，目标物在处理时损失越少，相对实验成本越低是改进原有实验方法的目标。一般对于含有复杂成分且目标分析物含量甚微的样品要去除干扰物质然后富集待测组分。固相萃取技术（solidphase extraction, SPE）应当是一个比较好的样品前处理方法。但是固相萃取技术的一个弱点是样品容易损失，回收率不高引起准确性不高。荷兰的Knoing教授使用亲和层析（affinity chromatography）的方法来提高待测物富集和纯化的效率。
可见食品中叶酸分析应该还是一个难点，同时又是一个热点。快速高效准确的方法会随着仪器性能的进步和方法的进一步完善成熟而成熟。
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