一、方法概述
适用范围：本标准适用饮料、配制酒、硬糖、蜜饯、淀粉软糖、巧克力及着色糖衣制品中合成着色剂（不含铝色锭）的测定。
原理：食品中人工合成着色剂用聚酰胺粉吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，用外标法定量。
二、仪器与试剂
1.仪器：
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。
1.2天平：感量位0.001g和0.00001g。
1.3恒温水浴锅。
1.4 G3垂融漏斗。
2. 试剂
2.1甲醇：色谱纯
2.2正己烷。
2.3盐酸。
2.4冰醋酸
2.5甲酸
2.6乙酸铵
2.7柠檬酸
2.8硫酸钠
2.9正丁醇
2.10三正辛胺
2.11无水乙醇
2.12氨水
2.13聚酰胺粉（尼龙）：过200μm(目)筛
2.14乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤。
2.15氨水溶液：量取氨水2mL，加水至1000mL，混匀。
2.16甲醇-甲酸溶液（6+4，体积比）：量取甲醇60mL，甲酸40mL，混匀。
2.17柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸，加水至100mL，溶解混匀。
2.18无水乙醇-氨水-水溶液（7+2+1体积比）：量取无水乙醇70mL、氨水溶液20mL、水10mL，混匀。
2.19三正辛胺-正丁醇溶液（5%）：量取三正辛胺5mL,加正丁醇至100mL,混匀。
2.20饱和硫酸钠溶液
2.21pH6的水：水加柠檬酸溶液调pH到6
3.22pH4的水：水加柠檬酸溶液调pH到4
三、样品的制备与保存
取具有代表性的样品混匀备用。
四、分析步骤
4.1、标准曲线绘制
4.1.1柠檬黄（CAS:1934-21-0）(来源：Dr Ehrenstorfer Gmbh 货号：C17138000)
4.1.2新红:（CAS:220658-76-4）（来源:农业部环境保护科研监测所:SB05-219-2008）
4.1.3苋菜红（CAS:915-67-3）(来源：Dr Ehrenstorfer Gmbh 货号：C11960500)
4.1.4胭脂红（CAS：2611-82-7）（来源：中国食品药品检定研究所货号：111771-201303）
4.1.5日落黄（CAS:2783-94-0）（来源：北京坛墨质检货号：BW901069-1000-L）
4.1.6亮蓝（CAS:3844-45-9）(来源：Dr Ehrenstorfer Gmbh 货号：C 10665200)
4.1.7赤藓红（CAS:16423-68-0）(来源：Dr Ehrenstorfer Gmbh 货号：C13205000)
4.1.2标准储备溶液：分别准确称取10.0mg柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红置于10mL容量瓶中，加pH为6的水到刻度，配成水溶液1000.0μg/mL。
4.1.3新红标准储备溶液：新红储备液浓度为100.0μg/mL。
4.1.4标准工作液：准确移取各储备0.01mL、0.025mL、0.05mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL于10mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，配成成浓度为1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL系列工作液；新红工作液浓度为：0.10μg/mL、0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL。
4.2样品的处理
4.2.1提取：
4.2.1.1果汁饮料及果汁、果味碳酸饮料等：称取20g-40g（精确至0.001g）,放入100mL烧杯中，含二氧化碳样品加热或超声驱除二氧化碳。
4.2.1.2配制酒类：称取20g-40g（精确至0.001g），放入100mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。
4.2.1.3硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取5g-10g（精确至0.001g）粉碎样品，放入100mL小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若样品溶液pH较高，用柠檬溶液调pH到6左右。
4.2.1.4巧克力豆及着色糖衣制品：称取5g-10g（精确至0.001g），放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，到巧克力豆无色为止，合并色素漂洗液为样品溶液。
4.2.2色素提取
4.2.2.1聚酰胺吸附法：试样溶液加柠檬酸溶液调pH值到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，搅拌片刻，以G3锤融漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3次-5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3次-5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3次-5次，每次5.0mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。经0.45μm滤膜过滤，取20μL进高效液相色谱仪。
4.2.2.2液-液分配法（适用于含赤藓红的样品）：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸，三正辛胺-正丁醇溶液（5%）10mL,振摇提取，分取有机相，重复提取，直至有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗涤2次，每次10mL，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加10mL正己烷，混匀，加氨水溶液提取2次-3次，每次5mL，合并氨水溶液层（含水溶性酸性色素），用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调和成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL，经0.45μm滤膜过滤，进高效液相色谱仪分析。
4.3.仪器测定条件
4.3.1色谱柱：XBP-C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5.0μm。
4.3.2流速：1.0mL/min。
4.3.3柱温：30℃。
4.3.4检测波长：254nm。

时间/min	A%(甲醇)	B%(0.02mol/L乙酸铵)
0	5	95
10	20	80
18	60	40
25	60	40
25.01	5	95
40	5	95

4.3.5流动相A相：甲醇 B相：0.02mol/L乙酸铵溶液。
五、结果处理

X(mmg/kg)=	C×V×1000
	m×1000

计算公式：
式中：X-样品中各着色剂组分的含量，单位为mg/kg；
C-由标准曲线查得试样中各着色剂组分的浓度为μg/mL；
V-试样溶的总体积，单位为mL；
m-样品的质量，单位g。
计算结果保留俩位有效数字。
六、验证结果
1.线性结果
将混合标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
同时做空白实验。
柠檬黄：Y=0.8576*X+0.0850 R^2=1.0000

新红：Y=0.4847*X+0.0078 R^2=0.9987

苋菜红：Y=0.7219*X+0.0512 R^2=0.9999

胭脂红：Y=0.8663*X+1.066 R^2=0.9999

日落黄：Y=0.8184*X+0.0519 R^2=1.0000

亮蓝：Y=0.1583*X-0.1380 R^2=0.9997

赤藓红：Y=0.6374*X-0.5787 R^2=0.9997

以上结果表明柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红在1.0μg/mL～25.0μg/mL范围内，各组分浓度和峰面积均呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
将5.0μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落换、赤藓红的检出限均为0.5mg/kg，亮蓝的检出限为1.0 mg/kg此检出限结果可以满足国标GB5009.35-2016的检出限的要求，故此方法满足条件。
七、方法精密度（重复性）
对LBF180700281样品分别进行6次加标重复性的测定，测定结果如下：

柠檬黄
测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	20.0085	20.0010	20.0058	20.0036	20.0101	20.0025
浓度（μg/mL）	2.4669	2.3672	2.5357	2.2699	2.324	2.4007
含量（mg/kg）	0.62	0.59	0.63	0.57	0.58	0.60
平均值（mg/kg）	0.60
RSD%	4.02
新红
测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	20.0085	20.0010	20.0058	20.0036	20.0101	20.0025
浓度（μg/mL）	0.3279	0.3673	0.3324	0.3343	0.323	0.3343
含量（mg/kg）	0.08	0.09	0.08	0.08	0.08	0.08
平均值（mg/kg）	0.08
RSD%	4.68
苋菜红
测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	20.0085	20.0010	20.0058	20.0036	20.0101	20.0025
浓度（μg/mL）	2.0511	2.0480	2.0672	2.0571	2.0238	2.0553
含量（mg/kg）	0.051	0.051	0.052	0.051	0.051	0.051
平均值（mg/kg）	0.51
RSD%	0.66
胭脂红
测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	20.0085	20.0010	20.0058	20.0036	20.0101	20.0025
浓度（μg/mL）	2.51	2.3853	2.4486	2.4890	2.4171	2.3811
含量（mg/kg）	0.63	0.60	0.61	0.62	0.60	0.60
平均值（mg/kg）	0.61
RSD%	2.19
日落黄
测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	20.0085	20.0010	20.0058	20.0036	20.0101	20.0025
浓度（μg/mL）	2.1302	2.1487	2.1192	2.1770	2.1712	2.1541
含量（mg/kg）	0.53	0.51	0.53	0.54	0.54	0.54
平均值（mg/kg）	0.54
RSD%	1.05
亮蓝
测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	20.0085	20.0010	20.0058	20.0036	20.0101	20.0025
浓度（μg/mL）	2.3685	2.3475	2.3643	2.3720	2.4065	2.3336
含量（mg/kg）	0.59	0.59	0.59	0.59	0.60	0.58
平均值（mg/kg）	0.59
RSD%	1.03
赤藓红
测定编号	1	2	3	4	5	6
质量（g）	20.0085	20.0010	20.0058	20.0036	20.0101	20.0025
浓度（μg/mL）	2.0624	2.1514	2.1737	2.1955	2.2062	2.2629
含量（mg/kg）	0.52	0.54	0.54	0.55	0.55	0.57
平均值（mg/kg）	0.54
RSD%	3.08

本方法的精密度均符合GB5009.35-2016中给出试样测试结果的精密度要求，因此，本次测定均符合要求。
八、准确度验证（加标回收）
对编号为LBF180700824样品进行加标，取1000.0μg/mL标液325μL进行样品加标，进行测定，结果如下：

测定编号		脱氢乙酸
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X含量（mg/kg）	平均值（mg/kg）	加标量（mg/kg）	回收率%
1#	20.0524	5.0	ND	ND	ND	/	/
2#	20.0661	5.0	ND	ND	ND	/	/
柠檬黄-QC	20.0036	5.0	5.8934	1.47	1.47	1.6	90.67
新红-QC		5.0	0.5903	0.15	0.15	0.16	90.82
苋菜红-QC		5.0	5.7851	1.45	1.45	1.6	89.00
胭脂红-QC		5.0	6.0338	1.51	1.51	1.6	92.83
日落黄-QC		5.0	6.1282	1.53	1.53	1.6	94.28
亮蓝-QC		5.0	5.9826	1.50	1.50	1.6	92.04
赤藓红-QC		5.0	5.9671	1.49	1.49	1.6	91.80