主题：【第十三届原创】高效液相色谱法同时测定食品中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、咖啡因、阿斯巴甜等7种添加剂

1、引言

    糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜是常用的甜味剂，苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠是常用的防腐剂。按GB 2760-2014，上述6种添加剂在诸多种类食品中都可使用。咖啡因也是一种常见的食品添加剂，并且在含茶、咖啡、可可的饮料和糕点中广泛存在。在实际生产实践中，对上述7种添加剂的测定属于常规需求，实施较为频繁。

    按GB 5009系列标准，上述项目均有标准方法，但较为分散。整理如下表



    上述7个项目隶属于5个不同的方法，需要分别测定，这就带来了诸多不便。考虑到五个标准方法由较多的相似性，只要确定了合适的色谱分离条件，上述7个项目完全可以整合到一个方法中进行测定。虽然有文献报道了相关的尝试（见：卫星华,李荣,董曼曼,艾芸,张亚锋,高安成.高效液相法同时测定饮品中8种食品添加剂[J].食品研究与开发,2017,38(24):137-140.），但是开发的方法需要梯度洗脱，单次分析需要40分钟以上，且每次进样之后需重新平衡。其他学者也进行了类似的研究，同样存在梯度洗脱时间长的问题（例如：姚浔平,李小平,姚珊珊,金米聪.高效液相色谱法同时测定食品中10种添加剂[J].中国卫生检验杂志,2009,19(01):9-11.）。使用超高效液相色谱法可以显著提高分析速度（见：高敬铭,刘莹,姬建生,符锋.超高效液相色谱法同时测定食品中5种添加剂[J].理化检验(化学分册),2016,52(01):29-32.），但是仪器要求提高，目前尚不普及。

    本文的主要目的是通过简便的等度洗脱方法实现上述7个目标物的快速分离，从而实现这7个项目同时测的，提高工作效率。

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2、实验方法

2.1  材料与试剂

    安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、咖啡因、阿斯巴甜标准品纯度均不低于99.5%  上海阿拉丁公司；甲醇（色谱纯）、磷酸二氢铵（分析纯）、氨水（分析纯）  上海国药试剂公司；实验用水为二次蒸馏水。

2.2  仪器与设备

    iChrom 5100色谱系统，配D5115二极管阵列检测器（DAD）  大连依利特公司；

    S210-B pH计、XP6微量天平  瑞士梅特勒公司；

    L400离心机  湖南长沙湘仪公司。

2.3  方法

2.3.1  样品处理

    液体样品（饮料类）：准确称取试样1.000 g置于15 mL离心管中，加入0.1 mol/L硫酸锌溶液5 mL、0.2 mol/L氨水5 mL，先机械振荡混匀，然后超声5 min，4000 r/min离心5 min。将上清液过滤到25 mL容量瓶中，沉淀加色谱流动相（见2.3.2）洗涤2次、每次8mL，洗涤液也滤到同一容量瓶中，用流动相定容。

    固体样品（糕点类）：称取食品试样20~50g（精确至0.01g） ，加水100~200g（精确至0.1g） ，用高速匀浆机充分破碎混匀。然后按液体样品同样方法处理。

    含油脂较多的样品：先按固体试样相同方法进行匀浆。称取匀浆后的样品1.0~2.0g（精确至0.001g）置于15 mL离心管中，加氨水（0.2mol/L）5mL、乙醇0.5mL，混匀后再加正己烷5mL，加盖后剧烈震荡5min，然后4000 r/min离心5 min使样品分层。用吸管吸出大部分正己烷弃去，然后再加正己烷5mL重复萃取一次 。弃去正己烷相，水相用氮气吹扫使残余的正己烷挥发，然后加入硫酸锌溶液（0.1 mol/L）5 mL，混匀并剧烈振荡5 min。4000 r/min离心5 min分离沉淀，将上清液过滤到25 mL容量瓶中，沉淀加色谱流动相洗涤2次、每次8mL，洗涤液也滤到同一容量瓶中，用流动相定容，待色谱测定。

2.3.2 色谱条件

    色谱柱：Thermo Hypersil C18 (4.6 mm × 200 mm, 5 μm)；流动相：甲醇/磷酸盐缓冲液体积比为20/80，其中磷酸盐缓冲液为0.1 mol/L磷酸二氢铵溶液用氨水调节至pH = 5.5；等度洗脱，流速为1.000 mL/min；柱温为30.0 ℃；进样体积为10.00 μL。使用DAD检测器，检测波长分别为：安赛蜜225 nm，糖精钠210 nm，苯甲酸222 nm，山梨酸250 nm，脱氢乙酸228 nm，咖啡因272 nm，阿斯巴甜210 nm。

2.3.3  定性与定量方法

    分别精确称量各标准品10.00 mg，定容至10 mL，制得浓度分别为1.000 g/L的单标储备液，其中安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜的溶剂为纯水，其余的溶剂为甲醇。

    依次准确吸取一定体积的单标储备液混合并用流动相（见1.3.2）稀释至1.00 ~ 50.0 mg/L的浓度范围，得到标准溶液系列。将标准溶液系列按相同色谱条件进行测定，以保留时间和DAD光谱匹配进行定性，以峰面积外标法建立工作曲线进行定量。

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3、问题讨论

3.1 色谱流动相选择

    原有方法测定7种目标物均采用反相色谱模式、C-18柱，本方法仍然选用C-18柱进行分离，因此实现分离的关键在于流动相的选择。

    首先进行了改变有机相比例的实验，但这方面对分离效果的优化并不明显。提高有机相比例时，各目标物的保留时间均减小，分离度也随之减小。降低有机相比例时分离度增加，但各目标物的保留时间都显著延长，总体分析时间太长，不实用。

    pH是影响这7种目标物分离的最重要因素。其中安赛蜜、糖精钠均为强酸盐、苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸钠均为弱酸盐，咖啡因是弱碱，阿斯巴甜属于两性物质，随着流动相pH的变化，其存在形式会有显著不同，保留能力也随之变化明显。有不少文献也考查了pH的分离的影响（例如：方晓丽.超高效液相色谱同时测定饮料中5种食品添加剂[J].食品工业,2018,39(12):314-318.| 汪辉,曹小彦,陈利国,黄秀明.高效液相色谱法同时测定蜜饯中5种常见食品添加剂[J].分析试验室,2007(11):119-122.| 尤妍,潘辉国,陈盼盼,董琴芳,章萍萍.高效液相色谱法同时测定饮料中5种添加剂[J].食品研究与开发,2016,37(04):164-166.| 姚浔平,李小平,姚珊珊,金米聪.高效液相色谱法同时测定食品中10种添加剂[J].中国卫生检验杂志,2009,19(01):9-11.），但是数据较为零散，并没有揭示出有用的变化规律，因此缺乏指导意义，实验结果也不易重复。本研究在较宽的范围内考查了各目标物保留时间的变化趋势，并对各目标峰的相对位置进行了对比，结果如下图：

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流动相pH对7种目标物保留时间的影响（流动相为甲醇/缓冲液=20/80）

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    糖精钠和安赛蜜都是强酸盐，相当于非常弱的碱，咖啡因本身就是极弱的碱，因此他们在弱酸性范围内存在形式不会有显著变化。只有在pH小于2之后，其保留时间才会水pH显著变化，但是通常色谱柱不能承受强酸，因此对pH小于2的情况不予考虑。阿斯巴甜是两性物质，在等电点附近呈分子内电离的形态，是保留最弱的。当pH增大或者减小时，其电离程度都是减小，保留时间都会表现为增大，但pH大于8是通常色谱柱不能承受的，因此也不予考虑。苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸都是羧酸，pKa均在5左右，因此其存在形式在pH从4到6变化时会显著不同，其保留时间在这个pH范围内也是变化最为显著的。pH减小时，羧酸形式存在占主导，因此其保留时间变大；pH增大时，盐形式存在的比例变多，因此保留时间减小；并且对于酸性强度不同的物质，其变化幅度和变化发生的pH范围也是显著不同的。相关理论在众多色谱专著中均有讨论（参见：Lloyd R.Snyder，Joseph J.Kirkland ，John W.Dolan，（译者：陈小明 唐雅妍），现代液相色谱技术导论，人民卫生出版社，2012.）。

    上述讨论也说明，对于酸类物质的色谱分析，一定要精确控制流动相的pH。有些标准中对流动相pH未作明确的说明，这是极为不妥的，试剂的微小差异就会导致分析结果显著不同。例如GB 5009.28-2016中只规定了流动相加入乙酸铵，但实际购买的乙酸铵试剂pH可在6.5~7.5范围内变化，有时候就会导致苯甲酸与糖精钠的峰位置前后互换。

    在明确了上述变化规律之后，流动相pH选择的问题也迎刃而解：显然在pH=5.5附近对于分离是最为有利的，不仅各目标物分离度较高，而且总的分析时间不太长，只需约15分钟。需要指出的是，由于pH计往往存在误差，实际配置缓冲液时并不一定按图中数值，而需要根据实际情况进行微调。若实测中发现脱氢乙酸与咖啡因分离度较低，说明配置的缓冲液pH略有偏低，应适当调高pH（通常调高0.1单位即可改善）；若实测中发现脱氢乙酸与山梨酸分离度较低，说明配置的缓冲液pH略有偏高，应适当调低pH（通常调低0.1单位即可改善）。

    在上述讨论的最佳流动相条件下，标样和实际样品的分离效果都很好，见下图：

标样和实际样品的色谱图（流动相为甲醇/缓冲液=20/80，缓冲液为0.1M磷酸二氢铵溶液用氨水调节至pH5.5）

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    另外要补充说明的是，虽然标准方法中使用的缓存盐常常是乙酸或者甲酸体系，但实际上并不是最佳选择。因为有机酸本身会产生一定的背景吸收，在低波长下尤其明显。而磷酸盐体系的背景吸收要小得多，这对减小背景干扰和基线漂移是有利的。

3.2 检测波长选择

    7种目标物的的吸收波长各不相同，用DAD检测器可较好解决问题，并且有助于通过吸收光谱图定性。若没有配备DAD检测器，可用一般可变波长紫外检测器的“波长时间程序”功能。

    通过较高浓度标样测得7种目标物的色谱-光谱图如下，其紫外吸收谱图和最大吸收波长可供参考。

    需要说明的是，糖精钠和阿斯巴甜的最大吸收波长都在较低波段，易受到背景吸收和样品基体的干扰，因此实际选用的是210nm进行检测，灵敏度虽然有所降低，但干扰也明显减轻。实际应用中发现，少数情况下，糖精钠仍然会受到基质干扰，此时可进一步将其检测波长降低到215~220nm，基质干扰基本上就减小到可忽略的程度了。

    另外，不同文献中报道的各种目标物的最大吸收波长有一些出入，这一方面与不同仪器的波长误差有关，更重要的是因为目标物的离解程度随pH变化，不同pH下测得的最大吸收波长会有明显差异。

3.3 样品前处理

    本方法参考现有方法，采用了锌盐沉淀的吸附和絮凝作用来净化除杂，但是未使用亚铁氰化钾和乙酸锌，也未采用三氯乙酸沉淀蛋白。因为这几种物质都有末端吸收，在接近210nm处产生的紫外吸收较为明显，而其色谱流出的时间又都与安赛蜜、糖精钠等物质接近（例如，三氯乙酸的流出时间与糖精钠几乎相同）。本方法采用氨水和硫酸锌生成氢氧化锌絮状沉淀，其吸附与絮凝效果与亚铁氰化钾-乙酸锌体系较为接近，同时不引入干扰离子。

    对于含油脂较多的试样，本方法仍采用正己烷萃取除脂，与常规方法基本一致。

3.4 方法验证

    对方法的重现性、线性范围、加标回收率进行了验证，详细数据较多，这里从略，主要结果如下：

    （1）标样7次重复测定的重现性很好，RSD均小于1%。但样品处理的重现性略差，同一样品匀浆后分别进行7次净化和测定，RSD在1%~3%。

    （2）7种目标物在1~50mg/L范围内线性相关系数均大于0.999，以取样1.0g计，测定范围相当于0.025~1.25g/Kg。考虑到添加剂的实际使用情况，未对更高含量水平进行验证。

    （3）按三倍信噪比估算，检出限均低于0.1mg/L，远低于常规检测范围，故未进一步对验证检出限。

    （4）进行了1g/Kg和0.1g/Kg两个水平的加标实验，阿斯巴甜的回收率略低，分别为94.1%和95.7%，其余目标物的回收率均在98%~101%之间。推测可能是阿斯巴甜容易被氢氧化锌沉淀吸附，导致回收率略低。

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4、结论

    （1）使用C-18色谱柱，使用甲醇与pH=5.5的磷酸盐缓冲液按20/80比例作为流动相，可以在等度洗脱条件下实现 安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、咖啡因、阿斯巴甜等7种物质的完全分离，分析时间约15分钟。

    （2）基于上述色谱分离方法，可以实现7种常见食品添加剂的同时测定，结果较为准确，可以用于生产实践。