一、方法概述
适用范围：本标准适用食品中诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的液相色谱检测方法。
原理：糖果、饮料中的人工合成着色剂用聚酰胺吸附法提取，过滤后，采用反相高效液相色谱技术进行分离测定，外标法定量。
二、仪器与试剂
1.仪器：
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。
1.2天平：感量位0.001g和0.00001g。
1.3涡旋混匀器。
1.4 离心机：最大转速1000r/min。
2. 试剂
2.1聚酰胺粉：200目。
2.2乙醇-氨溶液：取1mL氨水，加入100mL乙醇中70%。
2.3甲醇-甲酸溶液：取60mL甲醇和40mL甲酸混匀。
2.4 20%柠檬酸溶液，取200g柠檬酸溶液于1L水中。
2.5硫酸：10mL硫酸和100mL水混匀。
2.6 10%钨酸钠水溶液：取10g钨酸钠溶解于100mL水中。
2.7乙酸：色谱纯。
2.8甲醇：色谱纯。
2.9乙酸铵。
2.10诱惑红标准品来源：Dr.Ehrenstorfer GmbH 货号：C10125000
三、样品的制备与保存
3.1试样制备：从抽取得原始样品中取可食部分，均匀捣碎，液体样品混匀，将样品充分混匀，分出约500g，作为试样，装入清洁容器中，标明标记。
3.2试样保存，将试样冷藏保存。
3.3在抽样和制样过程中，必须防止样品收到污染。
四、分析步骤
4.1、标准曲线绘制
4.1.1日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红标准品：纯度＞98%。
4.1.2标准储备溶液：准确称取10.0mg诱惑红标品置于10mL容量瓶中，加pH为6的水到刻度，配成水溶液1000.0μg/mL。
4.1.3标准工作液：准确移取储备液2.5μL、5.0μL、10.0μL、25.0μL、50.0μL、100.0μL、250.0μL于10mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，配成成浓度为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL系列工作液。
4.2样品的处理
4.2.1提取：
4.2.1.1果汁和汽水等样品：取50mL样品加热，驱除二氧化碳，然后用水稀释定容经0.45μm滤膜过滤后供液相色谱分析。
4.2.1.2固体类样品：取已粉碎样品10g,加30mL乙醇-氨溶液溶解，置水浴上浓缩至20mL,用20%柠檬酸溶液调pH3.5-4.5，如需可加1mL10%钨酸钠溶液，使蛋白质沉淀，将上述溶液加热至70℃，加入聚酰胺粉1.0g,充分搅拌，用20%柠檬酸溶液调pH3.5-4.5,使色素完全被吸附，以3000r/min，离心3min,弃去离心后所得的上层清液，用甲醇和甲酸溶液洗去天然色素，再用水洗至溶液为中性，最后用乙醇-氨水溶液解析，至吸附剂为白色，收集解析液，加乙酸中和，定容至100mL，经0.45μm滤膜过滤后供液相色谱分析。
4.3.仪器测定条件
4.3.1色谱柱：XBP-C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5.0μm。
4.3.2流速：1.0mL/min。
4.3.3柱温：30℃。
4.3.4检测波长：254nm。
4.3.5流动相A相：甲醇 B相：0.02mol/L乙酸铵溶液。

时间/min	A%(甲醇)	B%(0.02mol/L乙酸铵)
0	5	95
10	20	80
18	60	40
25	60	40
25.01	5	95
40	5	95

五、结果处理
计算公式：

式中：
X-样品中诱惑红的含量，单位为g/L；
C-由标准曲线查得试样中诱惑红的浓度为μg/mL；
V-试样溶的总体积，单位为mL；
V1-样品移取体积，单位为mL；
六、验证结果
1.线性结果
将标准系列工作溶液注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
同时做空白实验。
Y=0.1084*X+06039R^2=0.9995

以上结果表明诱惑红在1.0μg/mL～25.0μg/mL范围内，R^{^2}=0.9995，诱惑红浓度和峰面积呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
将5.0μg/mL标准溶液逐级稀释至S/N=2.0，得出诱惑红的检出限为1.0mg/kg，此检出限结果小于国标SN/T 1743-2006的定量检出限2.5mg/kg，故此方法满足条件。
七、方法精密度（重复性）
对LBF180700284样品分别进行6次加标重复性的测定，测定结果如下：

测定编号	1	2	3	4	5	6
取样量（mL）	50.0	50.0	50.0	50.0	50.0	50.0
浓度（μg/mL）	6.1593	6.1804	6.1888	6.0971	6.1529	6.147
含量（g/L）	0.00616	0.00618	0.00619	0.00610	0.00615	0.00615
平均值（g/L）	0.00615
RSD%	0.53

本方法的精密度为0.53%，符合SN/T 1743-2006中给出试样测试结果的精密度要求，因此，本次测定均符合要求。
八、准确度验证（加标回收）
对LBF180700284样品加标，取1000.0 μg/mL的标液0.25mL、0.30 mL、0.40mL同样品同步处理后，结果见下表：

测定编号		诱惑红
序号	V1（ mL ）	V（mL）	C（μg/mL）	诱惑红含量（g/L）	平均值（ g/L ）	加标量（ g/L ）	回收率%
1#	50.0	50.0	ND	ND	ND	/	/
2#	50.0	50.0	ND	ND	ND	/	/
加标1#	50.0	50.0	4.9280	0.00493	0.00493	0.00500	98.6
加标2#	50.0	50.0	5.9642	0.00596	0.00596	0.00600	99.3
加标3#	50.0	50.0	8.2935	0.00829	0.00829	0.00800	103.6

由上表可以看出脱氢乙酸在添加浓度0.00500g/L-0.00800g/L范围内，回收率在98.6%-103.6%之间相对标准偏差为2.69%，小于国标要求应小于10%，符合规定要求。
九、总结
从检出限、线性范围、重复性、回收率测试结果可知，均符合方法要求，本实验方法符合SN/T 1743-2006的要求。

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