主题：【第十一届原创】食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠检测方法验证报告

食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠检测方法验证报告

GB 5009.28-2016（第一法）

李晓东

一、方法概述
1 范围
本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定方法。
本标准适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定。
2 原理
样品经水提取，高脂肪样品经正己烷脱脂、高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
二、仪器与试剂
1.仪器
1.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器
1.2分析天平：感量0.0001g和0.001g
1.3匀浆机
1.4恒温水浴锅
1.5涡旋混合器
1.6高速离心机：转速不低于8000r/min。
1.7超声波发生器
2. 试剂
除非另有说明，本方法所有实际均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
2.1甲醇：色谱纯。
2.2乙酸铵: 色谱纯。
2.3甲酸：色谱级
2.4氨水
2.5亚铁氰化钾
2.6无水乙醇
2.7正己烷
2.8氨水溶液：取1ml氨水加到99ml水中，混匀后备用。
2.9亚铁氰化钾溶液（92g/L）：称取106g亚铁氰化钾，加适量水溶解，用水定容至1L。
2.9乙酸锌溶液（183g/L）：称取220g乙酸锌溶于少量水中，加入30ml冰乙酸，用水定容至1L。
2.10乙酸铵溶液（20mmol/L）：称取1.54g乙酸铵，加入适量水溶解后用水定容至1L,经0.22μm水相微孔滤膜过滤后备用。
2.11甲酸-乙酸铵溶液（2mmol/L甲酸+20mmol/L乙酸铵）：称取1.54g乙酸铵，加入适量水溶解，再加入75.2μl甲酸，用水定容至1L，经0.22μm水相微孔滤膜过滤后备用。
3. 材料
3.1水相微孔滤膜
3.2塑料离心管
二、样品的制备与保存
取多个预包装的饮料、液态奶等均匀样品直接混合；非均匀的液态、半固态样品用组织匀浆机匀浆；固体样品用研磨机充分粉碎并搅拌均匀；奶酪、黄油、巧克力等采用50℃~60℃加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。取其中200g装入玻璃容器中，密封，液体试样于4℃保存，其他试样于-18℃保存。
三、分析步骤
3.1、标准曲线绘制
3.1.1苯甲酸：纯度≥99.0%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.1.2山梨酸：纯度≥99.0%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.1.3糖精钠：纯度≥99%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.1.4标准储备液：分别准确称取苯甲酸、山梨酸和糖精钠0.118g、0.134g和0.117g（精确到0.0001g），用水溶解并分别定容至100ml。此储备液各浓度为1000μg/ml。
储备液于4℃贮存，保存期为6个月。当使用苯甲酸和山梨酸标准品时，需用甲醇溶解并定容。
3.1.5标准混合中间液：分别取苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准储备液各10.0ml于50ml容量瓶中，用水定容。于4℃贮存，保质期为3个月。
3.1.6标准工作液：量取标准混合中间液适量，用水稀释成浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、25.0μg/mL、50.0μg/mL标准工作液。（临用现配）
3.1.7微孔滤膜：孔径0.22μm,有机相。
3.2 样品的处理
3.2.1含有胶基的果冻糖果等样品：
称取2g样品（精确到0.001g）于50ml具塞离心管中，加25mL水，置50℃水浴中加热溶解，取出后趁热超声20min, 冷却至室温，取出加入2ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加2ml乙酸锌溶液，于8000r/min离心机中离心5min，            取上清液于50mL容量瓶中，再加水20mL混匀后再超声5min后于8000r/min离心机中离心5min后合并上清液后再定容至刻度，上清液经0.22μm滤膜过滤，待测。
3.2.2奶油、油脂、巧克力、奶油、油炸食品类样品：
称取2g样品（精确到0.001g）于50mL具塞离心管中，加入10mL正己烷，置60℃水浴加热约5min，并不时轻摇以溶解脂肪，然后加25mL氨水溶液（1+99）1mL乙醇，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min，冷却至室温后，加2ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2ml乙酸锌溶液，于8000r/min离心机中离心5min，弃去有机相，水相转移至50mL容量瓶中，再加水20mL混匀后再超声5min，          后于8000r/min离心机中离心5min后合并上清液后再定容至刻度，上清液经0.22μm滤膜过滤，待测。
3.2.3一般试样：
称取2g样品（精确到0.001g）于于50mL离心管中加水25mL，在 50℃超声振荡提取20min后冷却至室温，取出加入2ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2ml乙酸锌溶液，于8000r/min离心机中离心5min取上清液于50mL容量瓶中，再加水20mL混匀后再超声5min后于8000r/min离心机中离心              后合并上清液后再定容至刻度，上清液经0.22μm滤膜过滤，待测。
3.3仪器测定条件
3.3.1色谱柱：C18柱, 250mm×4.6mm，5μm，或相当者。
3.3.2流动相：甲醇+乙酸铵溶液=5+95。
3.3.3流速：1.0ml/min
3.3.4波长：230nm
3.3.5进样量：10μl
（注：当存在干扰峰或需要辅助定性时，可以采用加入甲酸的流动相来测定，甲醇+甲酸-乙酸铵=8+92）
四、结果处理

结果表述:   
式中：X -试样中各组分的含量，(g/kg)； m-样品的质量，（g）；
      C-标准品的浓度，(μg/mL)；      V-样品最终定容体积，(mL)。
五、验证结果
1.线性结果
A.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中， 测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
苯甲酸  Y=34718.4*X-2258.22  R^2=0.9999618

表1 苯甲酸标准系列试验结果

（μg/mL）	0.1	0.2	0.5	1.0	5.0	10.0	25.0	50.0
A	3192	6472	15547	30792	171991	346341	857154	1737605

  以上结果表明苯甲酸在0.1μg/mL ~50.0μg/mL范围内，R=0.9999809,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
B.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中， 测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
山梨酸  Y=58106.6*X-2551.27  R^2=0.9998775

表1 山梨酸标准系列试验结果

（μg/mL）	0.1	0.2	0.5	1.0	5.0	10.0	25.0	50.0
A	6078	11004	27220	53019	266472	599121	1449933	2900929

  以上结果表明山梨酸在0.1μg/mL ~50.0μg/mL范围内，R=0.9999387,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
C.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中， 测定相应的峰面积，以混合标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
糖精钠  Y=28974.4*X-9635.15  R^2=0.9993261

表1 糖精钠标准系列试验结果

（μg/mL）	0.1	0.2	0.5	1.0	5.0	10.0	25.0	50.0
A	1855	4407	12203	25090	130262	261748	693650	1453554

  以上结果表明糖精钠在0.1μg/mL ~50.0μg/mL范围内，R=0.9996630,吸光值与浓度呈线性关系，线性良好，符合要求。
2.检出限结果
A.将0.2μg/mL苯甲酸标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出苯甲酸的方法检出限为 0.005mg/kg，此检出限结果满足条件。
B..将0.2μg/mL苯甲酸标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出山梨酸的方法检出限为 0.005mg/kg，此检出限结果满足条件。
C.将0.2μg/mL苯甲酸标准溶液逐级稀释至S/N=3±1，得出苯甲酸的方法检出限为 0.005mg/kg，此检出限结果满足条件。
七、重复性测定
A.对样品F1807000281进行7次进样，其苯甲酸测试值如下表所示：

编号	m（g）	C（μg/ml）	V（ml）	X(mg/kg)	X平(mg/kg)	RSD(%)
1	2.0223	6.02	50	0.149	0.149	0.10
2	2.0237	6.023	50	0.149
3	2.0186	6.002	50	0.149
4	2.0212	6.012	50	0.149
5	2.03264	6.033	50	0.148
6	2.0201	6.007	50	0.149
7	2.0195	6.004	50	0.149

本方法的精密度为 0.10% ，符合《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠测定方法》GB 5009.28-2016中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
B.对样品F1807000281进行7次进样，其山梨酸测试值如下表所示：

编号	m（g）	C（μg/ml）	V（ml）	X(mg/kg)	X平(mg/kg)	RSD(%)
1	2.0223	5.748	50	0.142	0.142	1.44
2	2.0237	5.727	50	0.141
3	2.0186	5.722	50	0.142
4	2.0212	5.702	50	0.141
5	2.03264	5.882	50	0.145
6	2.0201	5.657	50	0.14
7	2.0195	5.887	50	0.146

本方法的精密度为 1.44% ，符合《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠测定方法》GB 5009.28-2016中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
C.对样品F1807000281进行7次进样，其糖精钠测试值如下表所示：

编号	m（g）	C（μg/ml）	V（ml）	X(mg/kg)	X平(mg/kg)	RSD(%)
1	2.0223	5.891	50	0.146	0.145	0.64
2	2.0237	5.882	50	0.145
3	2.0186	5.887	50	0.146
4	2.0212	5.857	50	0.145
5	2.03264	5.85	50	0.144
6	2.0201	5.821	50	0.144
7	2.0195	5.793	50	0.143

本方法的精密度为 0.64% ，符合《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠测定方法》GB 5009.28-2016中给出的精密度要求。因此，本次测定均符合要求。
六、准确度验证（加标回收）
A.对样品F1807000281加标，取苯甲酸浓度100 .0 μg/mL的标液 0.01mL、0.04mL和0.1ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		苯甲酸
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X（mg/kg）	X平（mg/kg）	加标量（mg/kg）	回收率%
1#	2.0225	50	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	2.0236	50	N.D	N.D		/	/
加标1#	2.0216	50	0.984	0.024	/	0.0247	98.4
加标2#	2.0222	50	4.167	0.103	/	0.099	104
加标3#	2.0307	50	9.931	0.245	/	0.246	99.6

由上表可以看出苯甲酸的加标回收范围在98.4%-104.0% ，RSD值为2.93%符合规定要求。
B.对样品F1807000281加标，取苯甲酸浓度100 .0 μg/mL的标液 0.01mL、0.04mL和0.1ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		山梨酸
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X（mg/kg）	X平（mg/kg）	加标量（mg/kg）	回收率%
1#	2.0225	50	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	2.0236	50	N.D	N.D		/	/
加标1#	2.0216	50	0.982	0.0242	/	0.0247	98
加标2#	2.0222	50	3.986	0.099	/	0.099	100
加标3#	2.0307	50	9.196	0.226	/	0.246	91.9

由上表可以看出苯甲酸的加标回收范围在91.9%-100.0% ，RSD值为4.37%符合规定要求。
C.对样品F1807000281加标，取苯甲酸浓度100 .0 μg/mL的标液 0.01mL、0.04mL和0.1ml同样品同步处理后，结果见下表

测定编号		糖精钠
序号	m（g）	V（mL）	C（μg/mL）	X（mg/kg）	X平（mg/kg）	加标量（mg/kg）	回收率%
1#	2.0225	50	N.D	N.D	N.D	/	/
2#	2.0236	50	N.D	N.D		/	/
加标1#	2.0216	50	0.95	0.0235	/	0.0247	95.1
加标2#	2.0222	50	4.063	0.1	/	0.099	101
加标3#	2.0307	50	9.398	0.231	/	0.246	93.9

由上表可以看出苯甲酸的加标回收范围在93.9%-101.0% ，RSD值为3.93%符合规定要求。
七、总结
本方法的检出限为0.005mg/kg。等于GB 5009.28-2016中给出的最低检出浓度0.005mg/kg。本方法的精密度分别为2.93%、4.37%和3.93%。符合《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定方法》GB 5009.28-2016中给出的精密度要求.通过对食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定方法的检出限、精密度和准确度的评价，本方法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠数据准确，结果可信。此方法的准确性好，测定结果真实可靠，可用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定。