主题：【原创】【肌肽和鹅肌肽】极性太强保留不住分离不开，它在中性条件就轻松做到，你猜是哪款？

肌肽和鹅肌肽的液相拆分

肌肽（β-丙氨酰-L-组氨酸，L-Carnosine），是由β-丙氨酸和L-组氨酸两种氨基酸组成的二肽；鹅肌肽（β-丙氨酰-1-甲基-L-组氨酸，Anserine），为高度稳定的水溶性二肽，天然存在于脊椎动物的骨骼肌组织和脑组织中。
客户提供了肌肽和鹅肌肽单标，希望本实验室建立液相分离方法。由于肌肽和鹅肌肽二者结构只相差一个甲基，极性差异较小，相对分离难度大。
                                                                                     
                                                                    肌肽                                                          鹅肌肽
                                                              L-Carnosine                                                L-Anserine
                                                              MW：226.23                                              MW：240.26
首先，尝试使用键合立体笼状结构金刚烷基官能团的高表面极性色谱柱——CAPCELL PAK ADME，在酸性纯水相条件下进行分析，发现肌肽和鹅肌肽出现分离趋势，但由于保留时间较短，无法达到有效分离，结果如图1所示。

图1 CAPCELL PAK ADME在酸性条件下分析结果

为了延长保留时间，将0.1%磷酸水溶液更换为0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液，使用耐纯水的高极性色谱柱——CAPCELL PAK C₁₈ AQ色谱柱进行分析，希望能在离子对试剂的作用下加强保留。如图2，TFA条件下保留时间延长至4min，但分离趋势减弱；同时我们也将离子对试剂更换为辛烷磺酸钠，进一步延长了保留时间，但同样分离趋势不明显。

图2 CAPCELL PAK C₁₈ AQ色谱柱在TFA条件下分析结果

由于在酸性反相条件下保留时间较短未能得到分离，因此也考虑尝试使用HILIC模式加强保留。使用PC HILIC色谱柱在80%乙腈条件下进行分析，结果如图3所示，肌肽保留时间能够延长至10 min以上，但峰形较宽，无法得到二者分离。

图3 PC HILIC色谱柱分析结果

综合考虑上述分析结果后，继续尝试在碱性条件（pH 9.0）使用反相色谱柱进行分析。由于流动相条件碱性较强，且不含有机相，因此首先使用了耐碱性较强的CAPCELL PAK C₁₈ BB色谱柱进行尝试，如图4，在碱性条件下肌肽和鹅肌肽保留时间较长，且分离良好。

图4 CAPCELL PAK C₁₈ BB在碱性条件下分析结果

然而，考虑到碱性的纯水相条件非常苛刻，即使使用耐碱性色谱柱进行分析，仍可能对色谱柱自身寿命造成不良影响，因此我们进一步尝试将流动相条件由碱性调整为中性，同时比较耐碱型色谱柱BB和耐水型色谱柱AQ的分析结果。如图5，在中性条件下，耐水型色谱柱AQ的保留及分离情况要优于BB色谱柱。

图5 中性条件下CAPCELL PAK C₁₈ BB与AQ色谱柱分析结果对比

最终，我们选择CAPCELL PAK C₁₈ AQ色谱柱在中性分析条件下添加5%甲醇，同时优化柱温，得到最终分析结果如图6所示，肌肽与鹅肌肽之间分离度为2.82，能够达到基线分离。

图6 CAPCELL PAK C₁₈ AQ色谱柱优化条件分析结果

注：峰上标数字为分离度。

综上所述，使用CAPCELL PAK C₁₈ AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm色谱柱在中性高水相条件下可完成肌肽和鹅肌肽的良好保留与基线分离；实际样品分离过程中，客户可根据实际需要再做pH调整等措施来改善分离及保留。