主题：【第十一届原创】包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定

浏览0 回复15 电梯直达

我是风儿

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

鹤壁农检联合队发表于：2018/10/11 20:05:23 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

维权声明：本文为nphfm2009原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定

致病性
• 主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内
膜炎、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严重的流行性腹泻。
国内外污染情况- 参考文献
• 国内污染情况：
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。
• 国外污染情况：
-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜
绿假单胞菌。
• 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报道5加仑桶装产品（15～31天的保存期），铜绿假单胞
菌可生长繁殖达到 10^4 CFU/ml。
• 国内卫生标准：0 CFU/250ml

二、实验室检验

GB 8538-2016 铜绿假单胞菌检测（滤膜法）

原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。

操作步骤-水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。

可疑菌落计数情况
• 计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。（需要做绿脓菌素的测定）
• 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。
（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。）
• 将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。

纯化
• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养 20h～24h，对可疑菌进行纯化

将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验
• 氧化酶试验：
• 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。
• 操作：取2～3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。

产氨实验（乙酰胺肉汤）
• 原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色的络合物。
•操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。

产荧光素实验（金氏B培养基）
• 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是培养基的凝固。
• 操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上，于36℃±1℃恒温箱培养24h～5d。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。

计数结果说明
• 菌落计数公式：N＝P＋F(cF/nF)＋R(cR/nR)
- P是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌的菌落）。
- F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。
- R是呈红褐色的菌落数。
- nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。
- cF是产氨阳性的显荧光菌落数。
- nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。
- cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。

′样品稀释：若样品污染严重，建议对样品进行稀释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类推，进行系列稀释。
′报告：结果以 CFU/250ml计。