主题：【第十一届原创】AOA在线藻类分析仪比对结果和误差来源分析

      地表水体的富营养化引起藻类及其它浮游生物迅速繁殖，导致溶解氧下降，水质恶化，鱼类和其它生物大量死亡，甚至引发供水危机。色素是藻类光合作用时吸收、转化和传递光能的主要物质，叶绿素以多种形式存在于藻类植物中，大约占有机物干重的1-2%，是估算其生物量的重要指标，快速准确测定水体中叶绿素a浓度对于评价水体营养状态和水质管理具有重要意义。
    叶绿素测定方法有很多，大致分为萃取测定、荧光活体测定及水华遥感监测。萃取分析利用有机溶剂萃取植物细胞叶绿素进行光谱光度测定，根据分析技术的不同分为分光光度法、荧光法和高效液相色谱法。萃取分析只要操作准确，提取完全，可以得到准确和重复性好的结果，但是过程繁琐，不方便用于连续监测。
    AOA在线藻类分析仪利用叶绿素荧光特性进行分类定量分析，活体测量，无需样品预处理，仪器操作简单，可以快速地获得大量叶绿素数据，广泛运用在在线监测。为保证在线分析仪的有效运行，需要用标准样品来校准、性能考核和日常数据质量控制，但国内还未开发叶绿素的标准样品和质控样品，已知叶绿素含量（用萃取方法测定）的浮游植物悬浮液被认为是最好的标样替代品。当水体发生水华，生物多样性下降，往往是一种藻类成为绝对优势，可作为纯种藻类标准样品，本文将几个代表性的比对实验整理分析，探讨误差原因。
1.比对方法
1.1清洗AOA在线藻类分析仪蠕动泵、测量室及其底盖，检查纯水透光率值。
1.2水样不经任何处理，测量叶绿素浓度值。
1.3剩余水样酌量加入1%碳酸镁悬浊液(按1升水量加入1ml)，防止酸化。
1.4带回实验室，尽快分析，实验室分析方法依据《无水乙醇热浴超声法测定淡水中的叶绿素a》。
2实验
2.1微囊藻水样
2.1.1样品来源
      2014年8-10月某水库出现铜绿微囊藻水华，采集水华“浓密”处水样作为标准储备液，分别取0、2、5、10、15、20、25、50、100ml，用纯水稀释成500ml，检查两种方法叶绿素a和藻密度线性。取水库水华严重区、进水口、湖心和出水口四个水样，做实际水样比对分析。

2.1.2实验结果


表1微囊藻稀释水样比对结果




图2微囊藻水样线性比对

表2含微囊藻实际水样比对
表1、表2和图2表明，两种测量方法的结果与藻类数量之间存在非常显著的相关性，但AOA在线分析仪测量结果低于分光光度法，浓度越高，差异性越大。
2.1.3结果分析
2.1.3.1分光光度法误差分析
    萃取后叶绿素，对光照和氧气很敏感，极易造成不可逆的分解，因此，节时高效是分光光度法的质量保证，而温度是质控措施的关键。在超声波萃取过程，提高温度加快叶绿素溶出速度，同时，叶绿素降解的速度也是加快的，最佳超声波萃取条件：60℃萃取25分钟，2小时内完成测定。另外，实验室遮光也是必要。

2.1.3.2AOA荧光法误差来源
    AOA在线藻类分析仪原理：叶绿素具有荧光特性，一定的激励光，任何一种藻产生的荧光强度与其所含叶绿素a成正比，几种不同藻混合体产生的荧光强度等于各自荧光的总和。采用325纳米、450纳米、525纳米、570纳米、590纳米和610纳米作为激励光,其中325纳米是用来补偿黄色物质（有机物），测定685nm的光强，计算总叶绿素a值和不同藻的浓度。
（1）水样原始性状发生变化
暗室环境下，激励光照到藻上，能量分成三部分：光合作用、叶绿素自发荧光和热能辐射。如果藻的活性强，光合作用消耗的能量就越多，产生荧光的强度越小，反之，如果藻的活性弱，荧光强度就强。荧光能量和光合作用的能量是相互竞争的，叶绿素荧光常常被认为光合作用无效指标的依据。比对实验的样品，从采样经实验室样品处理，到水质自动监测站仪器分析，剩余样品送回实验室做分光光度法比对，再紧凑也需要3-4天完成，运输、保存过程，叶绿素在活体内也和其它物质处于不断更新变化中，可能衰老、也可能分解破坏，比对实验要求的同步水平也不可能实现，这是比对误差不可忽视的部分。
（2）微囊藻特殊的细胞结构使水样分布不均匀
微囊藻群体有胶鞘和伪空泡，可以自由漂浮在水中，水样在实验室静置一天后，出现明显的分层，测量过程难以保证均匀分布。

（3）工作温度与校准温度不一致
参考各类荧光法仪器说明书，浮游生物悬浊液的荧光反应受温度的影响很大，有些仪器的温度补偿2%⁄℃,但这种经验补偿不能保证准确的现场测量，因为每一种浮游植物的荧光强度随温度变化程度不同。这台AOA藻类分析仪安装测试在冬季，这次比对实验在9月份进行，温差亦有影响。
（4）浊度的影响
    实验室分光光度法经过0.8um滤纸过滤，比色扣除750nm吸光度值，只要操作正确，浊度的影响很小。
水中的悬浮颗粒物对激励光和产生的荧光有反射、散射和阻挡的作用，造成激励光和荧光产量的下降，YSI3026传感器检测结果：1NTU的 浊度影响大约是0.03ug/L叶绿素。
      除色素以外的细胞结构（细胞壁、胶被、储藏物质）以溶解有机碳为主要成分，对紫外光和蓝光具有强烈的吸收，也可视为影响测定的悬浮物，AOA在线藻类分析仪称之为黄色物质，用325纳米补偿。铜绿微囊藻细胞壁分为两层，内层是纤维素，外有胶鞘，有相当的厚度，互相溶合形成多细胞群体。图5显示黄色物质与叶绿素含量相关，AOA的测量结果反映了铜绿微囊藻细胞群体特征。
分光光度法和AOA扣除浊度方法各有不同，是否有可比性，有待进一步了解。

图5
（5）水样镜检微囊藻绝对优势，视野内不见其它藻类，AOA分析结果有少量绿藻、硅藻，其它的比对实验也出现藻类识别错误。
2.2薄甲藻水样


图6
2.2.1实验结果

表3薄甲藻水样比对结果
2.2.2结果分析
2.2.2.1镜检视野内为单一薄甲藻，与AOA定性结果相差较大。从图7可知，绿藻和硅甲藻的光谱图很相似，从光谱图识别绿藻和硅甲藻是困难的，AOA的藻类分类和藻密度估量值仅能作为参考，要将监测数据做水体生态评估的依据，必须结合实验室镜检和萃取分析方法。

图7
2.2.2.2薄甲藻AOA测量值约为光度法的1/3，薄甲藻有鞭毛，可以自由游动，离开有利的生活条件则很快失去活性，沉入水底不再活动，且细胞内容物溶出。不能保证水样原始性状，是叶绿素a比对测定误差的主要来源。

2.2.2.3薄甲藻细胞内容物溶出后，显微镜照片清楚看到细胞壁很薄，AOA测量结果印证黄色物质影响极小。
2.3小球藻


图9  小球藻
垃圾渗滤液水样，实验室放置几周，变绿，镜检结果：小球藻绝对优势，少量硅藻。
2.3.1实验结果

表4小球藻水样比对
2.3.2结果分析


图10小球藻水样线性分析
2.3.2.1藻类分类与实验室镜检结果基本吻合；
2.3.2.2低浓度出现少量蓝藻，因为仪器刚做完微囊藻样品，检测室可能有少量残留，比对实验之前彻底清洗检测室很有必要；
2.3.2.3分光光度法相关系数小于AOA，并非方法不可行，而是叶绿素萃取太依赖分析人员的操作，稍有疏忽就会造成萃取损失，相比之下仪器要稳定可靠些。
2.3.2.4小球藻叶绿素a测量结果AOA/分光光度法比值0.7-1.5，高于铜绿微囊藻和薄甲藻。两种方法测量结果比较接近的原因是因为小球藻不会运动，活体样品保持比较稳定的悬浮液状态，而AOA测量结果高于分光光度法的误差，一方面来自叶绿素和藻密度系数的确定，一方面来自萃取的损失。

图11AOA仪器校正界面
      荧光测定仪校准即确定叶绿素和藻密度相关系数，可以给活体叶绿素传感器提供的最好标准物是浮游植物悬浮液，此悬浮液亦有部分用萃取方法测定叶绿素含量，并且应该从监测地点获得，这样的标准物质产生的荧光可以尽可能接近现场的生物体。荧光测定同时受浊度、温度、细胞活性、不同藻的种类、大小、形状、和叶绿素种类的影响，这些都大大限制活体测量的准确度。
2.4不同水体样品分析

表5不同水体样品分析
2.4.1与单一藻类样品结果一致，绿藻含量高的水样AOA测量值偏高，微囊藻水样上浮分层、甲藻和裸藻活性降低下沉造成水样不均匀分布，是比对结果偏低的一个因素。而在线监测时，水样中的藻类足够鲜活，吻合度会好些。
2.4.2按照AOA提供的分类方法（图12），绿藻和蓝藻分类结果与镜检匹配，单一种类薄甲藻检测结果显示为绿藻、隐藻、蓝藻、极少量甲藻，镜检中数量可观的硅藻、裸藻在AOA测量结果中未见。

图12
2.4.3水库水质良好，杂质少，其它水体有机杂质含量相对高，AOA黄色物质测量结果与水体洁净程度吻合。
小结：萃取分析耗时长，不方便用于连续监测，需要有经验、高效率的分析人员才能得到准确、重复性好的结果。活体荧光法简便易操作，但准确度受更多因素的限制。两种方法不可互相替代，而应该取长补短，互为参照。
参考文献
  王丽娟，章岳蓬，郭步平等. 无水乙醇热浴超声法测定淡水中的叶绿素a.当代环保，2010，2（4）：14-17.