主题：【求助】询问下日本做四环素方法的细节

EDTA好像是乙二胺四乙酸二钠吧，你做的是日本哪个标准？

具体的标准号我不知道，这个应该是人翻译的我昨天试验了一下乙二胺四乙酸纳好像出不了峰，我试验了很多方法包括国标上的，但是土霉素，金霉素都不出峰真是郁闷啊！！

EDTA就是乙二胺四乙酸，而且我用咪唑流动相灵敏度也很高，就是回收不太好！

EDTA好像是乙二胺四乙酸二钠吧

(标准试料液)                                       
上记三种抗生物质标准品（盐酸盐）进行精确称量，溶解于甲醇里，调制成1mg（力価）/ml                                       
（1mgpotency/ml）的标准原液。适当稀释1.36%磷酸二氢钾作为标准试料液.                                       
↓                                       
提取方法                                       
样品5g＋含有EDTA2Na的柠檬酸缓冲液（Citrate buffer＋EDTA2Na）"1  30.0ml                                       
↓                                       
    均质*5000转5分                                   
50ML离心管里移液，用含有EDTA2Na的柠檬酸缓冲液（Citrate buffer＋EDTA2Na）10.0ml洗容器,洗液放入离心管                                       
↓                                       
远心离心  3000转10分钟                                       
↓                                       
精确的将上清液移到100ml分液漏斗里   
↓   
    边过滤
加正己烷(Hexane) 20ml   
↓    震荡5分钟
取水层放入100ml三角烧瓶   
如果水层分离较难时，实施远心分离   
↓   
SEP-PAK PS-2 Waters制   
1调整   
甲醇10ml   
D.W.10ml   
含有EDTA2Na的磷酸缓冲液（Citrate buffer＋EDTA2Na）5ml   
2.样品的负荷   
提取的水层20ml负荷   
3.洗净   
D.W.10ml
"1-3的溶出液废弃
4.溶出
用15ml的甲醇溶出，采取溶出液
↓

减压浓缩（40度以下）

在1ml (或2ml(1.36%磷酸二氢钾溶液里溶解
↓
HPLC分析


（分析条件）
1。四环素，土霉素
柱子（ODS系（4.6mm 150mm），40度
检出器：荧光（Ex）380nm,(Em）520nm
流动相:咪唑缓冲液”２：甲醇—＝１７：３
流速：0.８+1.0ml/min
2.金霉素
柱子（ODS系（4.6mm 150mm），40度
检出器：荧光（Ex）380nm,(Em）520nm
流动相:咪唑缓冲液”２：甲醇—＝3：1
流速：0.８+1.0ml/min

“1：含有EDTA2Na的柠檬酸缓冲液（Citrate buffer＋EDTA2Na）
柠檬酸21.0g放入1000ml的容量瓶作为A液
无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）71.6g放入1000ml的容量瓶中作为B液
把A液307ml放入盛有1.82gEDTA. 2Na的烧瓶里，放入B液193ml

“2：咪唑缓冲液
咪唑68.08g +EDTA 2Na0.37g+ 醋酸镁（Mg Acetate）10.72g在800ml的水里溶解
用醋酸（Acetic acid）调整成PH值为7.2后,放入1000ml的瓶中过滤

这个方法用的是FLD，不知你用的是哪个国标（18932 or 19684),这两个国标都是用VWD的。不过出峰还是没问题的，关键是注意溶剂和流动相的匹配，建议用流动相做最后溶剂。

土霉素、金霉素和四环素的检测方法

1. 分析目标化合物
土霉素，金霉素，四环素
2. 仪器设备
带荧光检测器的高效液相色谱仪。
3．试剂
除下列试剂外，使用附录2所列试剂。
咪唑：特级
咪唑缓冲溶液：将68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸镁溶解在800mL水中，用乙酸调节pH7.2后，加水至1,000mL。
含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液：第1液：将21.0g柠檬酸溶解在水中至1,000mL。第2液：将71.6g磷酸氢二钠溶解在水中至1,000mL。在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解。
苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg)：在内径8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色谱用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分离特性的物质。
4．标准品
盐酸土霉素：本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效价，分解点为190℃～194℃。
盐酸金霉素：本品1.000mg含有盐酸金霉素0.900mg以上效价，分解点为210℃以上。
盐酸四环素：本品1.000mg 含有盐酸四环素0.900mg以上效力，分解点为214℃以上。
5．试验溶液的制备
a 提取方法
①肌肉、肝脏和肾脏
肌肉：尽可能除去脂肪层，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
肝脏和肾脏：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心分离管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于上述分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
②    脂肪
脂肪：尽可能除去肌肉层，搅碎混合均匀后，称取其20.0g。
加入200mL正己烷，搅拌1分钟后，加入40mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，再搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。正己烷层中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，分取水层，合并于先分取的水层中。
③    奶
称取5.00g样品，加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液和20mL正己烷，用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
④    蛋
除去蛋壳，充分均匀后，称取其5.00g。加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，均匀后，加入100mL正己烷，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
⑤ 鱼贝类
有壳贝类：除去壳，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
其它的鱼贝类：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
b 净化方法
在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中，顺次注入10mL甲醇、10mL水和5mL饱和EDTA溶液，弃去流出液。柱中注入a提取方法所得的溶液后，注入10mL水，弃去流出液。注入10mL甲醇，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去甲醇。残留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氢钾溶液溶解，此为试验溶液。
6．操作方法
a 定性试验
按下列操作条件进行试验，试验结果必须与标准品的一致。
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm)。
柱：内径4.0～6.0mm，长150mm不锈钢管。
柱温： 40℃
检测器：激发波长380nm，发射波长520nm。
流动相：土霉素和四环素试验时，用咪唑缓冲溶液：甲醇(17：3)的混合溶液。调整流速使土霉素约5分钟流出。
金霉素试验时，用咪唑缓冲溶液：甲醇(3：1)的混合溶液。调整流速使金霉素约7分钟流出。
b 定量试验
根据与a 定性试验相同操作条件所得的试验结果，峰高法或峰面积法定量。
7．定量限
a 肌肉，肝脏，肾脏，奶，蛋和鱼贝类
土霉素：0.02 mg/kg
金霉素：0.03 mg/kg
四环素：0.02 mg/kg
b 脂肪
土霉素：0.005 mg/kg
8．注意事项
(1) 试验溶液的制备
① 离心分离温度保持在室温。
② 抽滤后滤液混浊时，滤液再次进行离心分离。
③ 在苯乙烯二乙烯苯共聚物柱色谱中，注入试验溶液后，30mL水分数次加入效果较好地洗浄柱中残留的乙二胺四乙酸。
(2) 标准溶液的配制
①称取相当于10.0mg土霉素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为土霉素的标准原液（土霉素1,000mg（效价）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
②称取相当于10.0mg金霉素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为金霉素的标准原液（金霉素1,076mg（效价）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
③称取相当于10.0mg四环素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为四环素的标准原液（四环素1,082mg（效力）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
④用1.36%磷酸二氢钾溶液将土霉素，金霉素和四环素各标准原液递减稀释，作为制作标准曲线用的标准溶液。
(3) 其它
①同时进行很多样品试验的筛选试验法提高判断効率时，用「○土霉素，金霉素和四环素的筛选法（参照117 页）」判断为陽性的，不妨用本检测方法实施试验。
②使用本检测方法检出土霉素，金霉素和四环素时，最好用带质量检测器的高效液相色谱仪确证。
9．参考文献
无
10．类型


是不是这个方法？？