主题：【分享】欧盟兽药检测方法(之一)共40多个

GCMS法测定动物组织中雄激素，雌激素和孕激素的残留量（EEC，确证法）


A Multi-Residues Method Using GC/MS for Determining Residues of Anabolic Agents (Androgens, Destrogens and Gestagens) in Animal Tissues
(EEC, Cy1.2 Confirming Method)

引言
根据EEC，人类食用动物中禁用非生物合成激素。同时，进口及欧盟内部生产的动物产品中这些合成激素内残留的MRL为零。在严格控制的条件下可以使用天然甾族化合物或其酯（见EEC 指令86/469/ EEC），并且确定了可食用组织中的天然甾族化合物的最大允许含量（见section 2,2.3）。

1 主题内容
本多残留分析方法用于动物性样品的大量合成激素中单个药物的检测和确证——本方法主要用于可食组织中残留物的检测。这项研究是德国官方根据残留指令（86/469/ EEC）实施的。

2．应用范围
本方法用于日常筛选和确证可食用组织样品中被分析物。
本方法适用于睾酮（testosterone）*，雌二醇（oestradiol）*，雌三醇（oestriol），雌烷（oestrone），己烯雌酚（diethylstilboestrol），乙雌醇（hexoextrol），双烯雌酚（dienoestrol），乙炔基雌二醇（ethinyloestradiol）*，19-去甲基睾酮（19-nortestosterone），甲基睾酮（19-nortestosterone），雄烯二酮（androsterone）， （boldenone），氯睾酮（chlorotestosterone），6α-甲基-17α-乙酸基孕甾酮（medroxy-progesterone acetate），孕甾酮（progesterone），羟基孕甾酮（hydroxyprogesterone）。

* 17α-或17β-羟基化合物

德国7个实验室间的数据比对表明，小牛肉中DES和DE的检测限量>0.5 g/kg , EE和NT的检测限量>1 g/kg。

3．参考资料

Commission Decision, 93/256/EEC, laying down the method for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action. [OJ. N.L. 118, 14.4.93. pp 64-74]

2052/VI/84 File 6.11 II-4, Scientific Veterinary Committee, Working Group - "Reference Methods for Residues", General Criteria for the establishment of Reference Method for the Detection of Residues.

ISO Standard 78/2-1982 Layout for standards - Part 2: Standard for Chemical Analysis

Official Collection of Method of Analysis according to $ 35of the Foods Act (LM8G) Examination of Foodstuffs, Germany. (1989) Bundesgesundhbl. 2-76-80

Bergner-Lang, B. And Kachele, M. (1981). Anabolica in Kalbfleisch - Nachweis und Bestimmung, Befund und Beobachtungen. Dtsch. Lebensm.- Rundschau, 77,305-313

Bergner-Lang, B. And Kachele, M. (1987). Anabolica in Kalbfleisch - Nachweis und Bestimmung, Befund und Beobachtungen. Dtsch. Lebensm.- Rundschau, 83,349-351

Bergner-Lang, B. And Kachele, M. (1989). Anabolica in Kalbfleisch - Nachweis und Bestimmung, Befund und Beobachtungen. Dtsch. Lebensm.- Rundschau, 85,78-79

4．定义
合成激素的含量是指按照本方法测得的不考虑其化学形式的合成激素的量，以 g/kg表示。

5．方法提要
5.1 本方法包括8个步骤：
1． 初步提取准备
2． 酶共轭水解
3． 有机溶剂提取
4． XAD-2柱净化
5． 用Extrelut和氧化铝柱分离雄激素、雌激素和孕激素
6． 衍生为三甲基硅烷酯
7． GC/MS检测和鉴定
8． 结果计算

6．试剂

注：已知所列举引证来源的试剂是令人满意的，不过其它来源的试剂可等同适用。除非另有规定，试剂均为AR级。

6.1. 标准物质和标准溶液
6.1.1 2 g/mL甲醇溶液，在4℃下避光贮存于棕色玻璃瓶中。
6.1.2 雌激素类用1μg/mL二氯酚甲醇液作内标。
6.1.3 雌激素和孕激素类用2μg/mL3,4-13C-睾丸素（睾酮）甲醇溶液作内标。

6.2. 试剂
6.2.1. 丙酮
6.2.2. 乙醇
6.2.3. 正己烷
6.2.4. 甲醇
6.2.5. 甲苯
6.2.6. 氯仿
6.2.7. 二氯甲烷
6.2.8. 乙醚(不含过氧化物)
6.2.9. 异辛烷；2,2,4-三甲基戊烷
6.2.10. 乙腈
6.2.11. 醋酸
6.2.12. 醋酸钠
6.2.13. 氢氧化钾（0.25mol/L）
6.2.14. β-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶(Industrie Biologique, France, code IBF 213473)或(Boehringer Mannheim,Germany,art no. 127060 or 127698)（每毫升含100,000单位β-葡糖苷酸酶和1000,000单位硫酸酯酶）

6.3. 衍生化试剂
6.3.1 60份乙腈与40份含有5%（以质量计）作催化剂的三甲基氯硅烷(TMCS)的 N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺（MSTFA）（V/V）混合。新鲜配制。
6.3.2 200mg二硫赤藓糖醇和100mg碘化铵在顶空瓶中溶解于5mLMSTFA中，此顶空瓶置于60℃的烘箱中。一份这样的溶液与9份MSTFA（V/V）混合。（黑暗处稳定放置1个月以上）。用前一份这样的溶液与一份乙腈混合成硅烷化试剂。
6.3.3 七氟丁酸酐（HFBA），
6.4. 缓冲溶液
6.4.1 醋酸缓冲溶液，0.04mol/L，pH 5.2
将25.2g醋酸和43.0gNaAc 3H２O溶于1000mL水中。
6.5. 层析柱装填
6.5.1 XAD-2树脂（300-1000μm）
预处理-在甲醇中将需要的树脂和低分子量物质及混浊物分开。50g树脂添加到250mL乙醇中且搅拌3min。在500mL量筒中沉淀2min后虹吸移出。树脂中再加入250mL水，悬浮后放置5min，倾去水，树脂以湿态保存。
6.5.2 Celite颗粒：（Extrelut Merck art No. 11038）。存放在有干燥剂（如氯化钙）的干燥器内。
6.5.3 氧化铝
预处理：20g氧化铝装填于带有玻璃塞的广口瓶中，加1.2mL蒸馏水。剧烈振摇，室温下静置过夜。

7. 仪器设备
该文中列出的仪器生产公司和生产厂仅是起到提供信息的目的。其它型号和生产厂设备也可等同使用。

7.1.1. 烧杯,250mL
7.1.2. 玻璃巴斯德毛细移液管
7.1.3. 自动移液管（例如Gilson P20，P200，P1000，P5000）
7.1.4. 离心机（例如 RC-3,Sorvall）
7.1.5. 离心管，如果是不锈钢的体积不少于250mL
7.1.6. 带有玻璃电极的pH计
7.1.7. 能够调节温度的电水浴
7.1.8. 涡旋混均器（Vortex-genic, Wilton&co）
7.1.9. 小过滤漏斗
7.1.10. 分液漏斗，500mL
7.1.11. 带有螺旋盖（chromacol 85c）和内衬垫（chromacol 8-ST15）的玻璃衍生化瓶（chromacol 250（A）），或尖烧瓶或圆锥型具玻璃塞的试管二者挑一。
7.1.12. 带有通氮装置的耐热型衍生化瓶（pierce no. 18790）
7.1.13. 带玻璃内衬（chrompack,art.no. 10381）的玻璃进样瓶（chropack,art.no. 10210）
7.1.14. 铝盖（chrompack,art.no. 10210）
7.1.15. 尖底烧瓶，100mL
7.1.16. 带水浴的旋转蒸发器，可控温在40±2℃
7.1.17. Ultr-Turrax均质器
7.1.18. 控温在40℃的干燥或真空箱
7.1.19. 圆底烧瓶，500mL
7.1.20. GC-MS设备
7.1.20.1 毛细管GC，带有全玻璃进样器，可升温到250℃以上和不分流操作
7.1.20.2 GC自动进样器，不是必须的
7.1.20.3 一个低分辨MS，质量范围不少于600amu。该仪器必须具备多离子检测（MID）方式。也可以是专用的质量检测器和离子阱检测器
7.1.20.4 工作站（例如hp, 59970型）
7.1.20.5 打印机
7.1.20.6 色谱柱，熔融石英OV-1，SE-30或SE-54，25m×0.32mm ID，膜厚0.30-0.50μm
7.1.20.7 GC-MS的连接原则上要求熔融石英毛细管柱能够在280℃以上的温度下使用
7.2. 柱子
7.2.1 柱子要求玻璃材质，一个截门和玻璃磨口活塞。尺寸为：
Extrelut和XAD-2 柱250mm×8-10mm i.d.，Al2O3 柱150mm×8-10mm i.d.
7.2.2 Amberlite –XAD2 柱：8g树脂（6.5.3）被悬浮在30mL水中，然后用悬浮液形成约8cm高的柱子。用50mL水冲洗树脂。
7.2.3 Extrelut柱粒状的填料：取1.5g预处理过粒状的填料（6.5.2）用0.75mL KOH（6.2.13.）在一具塞烧瓶中并充分振摇。持续15min后填充一个柱子的一半，用甲苯：正已烷 1：9（V/V）并用一漏斗加入柱中处理填料。柱子再用20mL甲苯：异辛烷 1：9（V/V）冲洗。柱子不能干。
7.2.4 氧化铝柱：4g预处理过的氧化铝（6.5.3）与10mL甲苯混合，将悬浮的液灌入一柱中。排出液体形成柱床后，用15mL甲苯：异辛烷 1：9（V/V）洗之。当柱床顶部上方有3-4cm液体时轻轻敲打使之装紧。
7.2.5 Extrelut柱装在氧化铝柱的上面，以便当从Extrelut柱中流出的液滴直接进到氧化铝柱。