三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。
2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer(快捷键: +B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3.从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1,2,3,4获得此四个对话框。
4.在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode):线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDM Param选择FL2,而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量;分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDM Param选择FL2;分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量。
5.放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH 或LOW上。
6.在Acquisiton Control对话框中,选取Acquire,开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“”。
7.在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度:PMT voltages(粗调)与Amp Gains(细调),使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布。
8.在Threshold 对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号(细胞碎片)。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H。Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量。
9.从屏幕左列绘图工具中选取Region(区域),并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10.Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内。
11.在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2- 的细胞群却分布在FL1+ FL2+区域内,则需调大FL2-?%FL1中的“?”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12.在Status对话框中可见:Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW;Laser current:正常值为6Amps左右。
13.调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可。
本计算机中已有三个名叫储存于FACStation G3 \BD Applications \CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings及FACStation G3 \BD Files \Instrument Settings Files \CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞。