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主题：【原创】蛋白质重组表达研究简述－－从基因克隆到蛋白纯化及功能研究

浏览0 回复44 电梯直达
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发表于：2009/06/12 22:47:13 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
该帖子已被madprodigy设置为精华；
这个题目列得很宽很大，主要是本人在实验过程的一些体会和整个实验流程的整理，我希望我能够有足够的时间可以将个人的一些认识跟大家分享一下。希望大家能够共同努力共同分享。
  估计跟目前流行的小说或者blog连载类似。今天开个头，希望我能够坚持写好。
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2009/6/14 21:35:23 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
基因--有遗传效应的DNA片断,是控制生物性状的基本遗传单位。
　　人们对基因的认识是不断发展的。19世纪60年代，遗传学家孟德尔就提出了生物的性状是由遗传因子控制的观点，但这仅仅是一种逻辑推理的产物。20世纪初期，遗传学家通过果蝇的遗传实验，认识到基因存在于染色体上，并且在染色体上是呈线性排列，从而得出了染色体是基因载体的结论。
　　20世纪50年代以后，随着分子遗传学的发展，尤其是沃森和克里克提出双螺旋结构以后，人们才真正认识了基因的本质，即基因是具有遗传效应的DNA片断。研究结果还表明，每条染色体只含有一个DNA分子，每个DNA分子上有多个基因，每个基因有含有成百上千个脱氧核苷酸。由于不同基因的脱氧核苷酸的排列顺序（碱基序列）不同，因此，不同的基因就含有不同的遗传信息。


以下资料为关于基因及其一些技术和应用的一些更的介绍，算是对生命科学的一个门槛认识。



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2009/6/14 22:18:55 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
对于基因的克隆，首先是要求对基因序列的了解。其中包括基因组DNA和编码cDNA序列。基因的克隆往往也是需要基因组DNA和cDNA都需要克隆的。
对于基因序列的了解，我们最好的数据来源无疑是NCBI的Gene bank。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

输入所需要研究的基因或者其编码蛋白的名称就可以查找到目前已提交的基因序列。这些同源序列，部分同你所需要研究的序列的同源程度有可能是99％，因此非常具有参考价值。以laccase 为例进行搜索



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2009/6/15 12:46:12 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
还有一种情况是已知的基因序列，希望再次扩增获得到，或者跟其他基因比对看看差异性。这个还是查询NCBI －blast.



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2009/6/15 13:12:38 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
然后选择基因的原来，以鼠源为例




输入基因序列，序列也可以直接Copy过来。然后直接Blast，最后的结果是按照同源性高低排序的。

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2009/6/15 17:25:02 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
当获得一个基因序列后，随后的工作就是基因的克隆。

基因的克隆分两个：
(1)基因组DNA的克隆，这个相对比较容易一点。也是分子生物学的最基本的技术方法了。
（2）cDNA的克隆。这个比较复杂，难度也会大一些。主要是为了获得具有翻译表达的功能单元。

首先说一下基因组DNA的克隆技术路线
1）用于提取基因组DNA的组织或者样品
2）配制所需的多种buffer和试剂（目前已有很多种试剂盒）
3）按照一定的技术路线提取基因组总DNA
4）检测。一般常规均为酶切电泳检测，这其中就涉及到两种常规的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和PAGE电泳。
5）PCR引物设计。根据从NCBI上已知的或者同源的保守序列涉及引物，用于扩增DNA。
6）PCR扩增。是一项简单常规而又复杂的技术。目前该领域研究得很多，各种商品化的产品非常多。
7）电泳检测。
8）回收目标产物。目前已有很多试剂盒产品。
9.1）直接测序或者 9.2）构建克隆后再测序。
9.2.1）目标产物与载体连接
9.2.2）转化感受态细胞
9.2.2）目标克隆筛选
9.2.3）目标克隆PCR和酶切检测确认
9.2.4）克隆测序
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2009/6/15 17:39:56 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
其实上生命科学类研究的技术我个人认为是最复杂，最痛苦的，也最烦人，最消耗时间的事情了。
例如:配制一个实验室常规的PBS pH7.4 buffer
1）洗烧杯，洗瓶子，药勺，磁力搅拌器转子或者玻璃棒。先自来水，然后去离子水涮洗。
2）找到3个试剂。计算好3个试剂的量。
3）称量，配制
4）pH调节。还要校准pH计。
5）定容
到以上步骤1h消耗完毕。
6）部分实验需要0.22um膜过滤
7）部分实验要求121C灭菌。

以上仅仅为一个buffer而已。。。
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2009/6/15 17:45:53 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
实验室的buffer真是比较恐怖的，不同pH的，不同盐的，不同盐离子浓度的，不同离子调节的。

（1）25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制
pH 1mol/L K2HPO4(ml) 1mol/L KH2PO4(ml)
5.8    8.5    91.5
6.0    13.2    86.8
6.2    19.2    80.8
6.4    27.8    72.2
6.6    38.1    61.9
6.8    49.7    50.3
7.0    61.5    38.5
7.2    71.7    28.3
7.4    80.2    19.8
7.6    86.6    13.4
7.8    90.8    9.2
8.0    94.0    6.2

（2）25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※
pH 1mol/L Na2HPO4(ml) 1mol/L NaH2PO4(ml)
5.8    7.9    92.1
6.0    12.0    88.0
6.2    17.8    82.2
6.4    25.5    74.5
6.6    35.2    64.8
6.8    46.3    53.7
7.0    57.7    42.3
7.2    68.4    31.6
7.4    77.4    22.6
7.6    84.5    15.5
7.8    89.6    10.4
8.0    93.2    6.8
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2009/6/15 17:48:58 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
算是发一点牢骚吧，再列给别常用buffer

常用的电泳缓冲液
缓冲液    使用液    浓贮存液（每升）
Tris-乙酸（TAE）    1×：0.04mol/L Tris-乙酸    50×：242g Tris碱
　             0.001mol/L EDTA    57.1ml冰乙酸
　    　    100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-磷酸（TPE）    1×:0.09mol/L Tris-磷酸    10×:10g Tris碱
　             0.002mol/L EDTA    15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）
　    　    40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-硼酸（TBE）a    0.5×0.045mol/L Tris-硼酸    5×：54g Tris碱
　             0.001mol/L EDTA    27.5硼酸
　    　    20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
      碱性缓冲液b    1×:50mmol/L NaOH    1×:5ml 10mol/L NaOH
　             1mmol/L EDTA    2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
Tris-甘氨酸c    1×:25mmol/L Tris    5×:15.1g Tris
　             250mmol/L 甘氨酸    94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3）
　             0.1% SDS    50ml 10% SDS(电泳级)
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〓疯子哥〓
madprodigy
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2009/6/15 17:57:02 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
有仪器操作的图片么？发点上来看看

希望有更多的做生物检测的同行能加入进来，多谢谢你们在操作的经验收获心得
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2009/6/15 18:58:47 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 madprodigy 发表:
有仪器操作的图片么？发点上来看看

希望有更多的做生物检测的同行能加入进来，多谢谢你们在操作的经验收获心得


建议特别好，没有想到。生命科学研究所涉及到的仪器太多了，大大小小的。我会尽量在提到某项技术的仪器时提供照片和仪器的简要说明。
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