主题：【讨论】光度准确度测定的意义是什么？

我谈点看法吧，吸光度A或透光率T的测定是一种相对测定，即，通过自动或手动调整仪器，使参比液为T=100%，不透光时为T=0%.虽然现在的仪器都用软件来自动调整了，但机器内部仍需要确定这个相对标准，试液产生紫外或可见部分吸收时，正是在这一标准的基础上进行“比较”得到的数值，因此不同的仪器或实验室在测定同一个样品含量时，才可能得到符合误差要求的测定结果（指相互的偏差符合要求）。在不同仪器上测量时，虽然各自的光电流、分光精度、比色皿本身的透光率等会存在偏差，但作仪器调零、参比液调T=100%的过程中，已经通过“相对测量”而得以消除这些“个性”影响，因而样品测定中得到相同或相近的结果。在消除了这些影响之后，再来看A=εbc，对于确定的待测物而言，只要测定体系恒定、波长恒定（这一点很重要）、校正仪器和测定试液时都使用同一个比色皿（这一点也很重要），则同一浓度的重铬酸钾都有相同的吸光度A，或透光率T。因此，最大摩尔吸光系数被视为常数才具有参考的意义，所有手册上列出ε的具体数据才会相同或相近（数据出处不同会略有差别）。版主给出235nm 透过率是0.180，在不同仪器上测量都相同，应该是这个原因。
　　　为什么同一溶液在不同的仪器上会测出不同的A或T呢？我认为，不是仪器本身的问题（仪器厂家不同，精度会有差别），主要是下面几个原因引起的：
　　　1、仪器调零、参比液调T=100%及仪器的其他校正没有使用同一套比色皿，因而仪器的“个性”误差作为系统误差引入到测定的A或T值中，产生不同仪器的测量差别。
　　　2、波长调节不精确，虽然现在都是电脑控制的软件调节，但机器内部仍要驱动硬件来截取单色光，机械移动时产生微小的波长差异是可能的，但这种差异性在最大吸收波长下测定是可以忽略的，因为在峰值处左右变化1-2nm，应该还会在一个平台上，即它们的A或T相同，换言之，在最大吸收波长左右正负1-2nm的两个波长下，它们的摩尔吸光系数与峰值处的相同或极相近。如果将该溶液放在吸收峰的“腰”波长上来测量的话，分析一下在指定的λ左右变化1-2nm的两个波长的A或T，则差别会很大，说明，虽然只有极小的波长变化，但对应的摩尔吸光系数却有较大的差别，即：不同仪器，在最大吸收波长以外的其他波长处测量时，会因各仪器的波长调节的精度不同而产生明显的差异。这可能是使用不同仪器测量时产生偏差的主要原因。
　　　我们一般选择最大吸收波长来测量试液，原因之一是灵敏度最大，原因之二还在于避免波长微小变化而引入的测量误差。
　　　在双波长测量混合液或消除吸收干扰的情况下，（2）的影响尤其要特别注意。
　　　如果用标准曲线法或回归直线方程法，由于一组标准溶液和试液都在同一波长下测量，即使波长微小变化，引起了ε的微小变化，但由此引入的误差为系统误差，所有数据都系统偏高，或偏低，只是曲线的斜率偏大一点或偏小一点，仍为直线，并不影响结果，作回归方程时，也是一样的。当然，如果仪器曾调整过波长，工作曲线或回归方程都应该另做。
　　　我不认为厂家在仪器校正时，专门用某标准溶液做到使某波长下的测定非常准确，其他波长下不作校正。厂家应该校正的是各波长的实际值与界面上显示的波长数是否一致。这个校正工作可以用几台仪器对同一个标准溶液（重铬酸钾溶液比较恰当，因为它在全波段至少有三个峰，很丰富）进行波长扫描，然后导出数据后在excel或origin的同一张表中作图，比较曲线是否有明显差别。
　　　版主说重铬酸钾标准溶液在235nm下，透过率是0.180，可用于校正仪器，这是好的建议。

记得过去很多721都有这种问题，现在可能还是有。一些普及型仪器即使校正好以后，仪器之间吸光度测试的绝对差异有时确实较大。这使得每台仪器测得的吸光系数都没有可比性，只能在一台机子上进行比较，个中原因实在搞不太清。1楼朋友写的原因可能是一个重要因素。但有时两台仪器波长调准了，样品在两台仪器间也会有较明显的测试差异（吸光系数不同）。

我想除了波长准确性，还可能有杂散光、带宽等因素，检测器对不同的波长也存在有一定非线性。对于普及型仪器，厂家也不可能对每个波长进行校正，况且不同标准样品的校正方法可能也会有一定差异。因此，仪器设计只能根据原理和测试范围进行。生产出来的仪器也只能使用特定材料，在特定条件下校正，只能考虑一定使用情况。对这类仪器的使用者，光度准确度测定后，只能说仪器调到一个公认的可用范围了，意义可能仅此而已。

原文由 zlhuang0132 发表:
　　　版主说重铬酸钾标准溶液在235nm下，透过率是0.180，可用于校正仪器，这是好的建议。

同意二楼的分析及观点。

个人认为A或T都是绝对值，应该是在每台仪器上的结果一样。

如果能够排除人为的影响及试剂本身的影响，透过率应该为0.18. 数据的超差表明仪器本身的系统误差。

感谢下二楼的这么认真的答复。很多想法很有启发性。

tutm老师你接触的仪器多，不知道用单点法的话，只看吸光度，那不同仪器是不是值绝大多数都不同呢？

auto1235的绝对，提示了我，分光光度法是相对测量，所以，不同仪器按道理是不可能相同的，除非你根据这个吸光度指标来设计。因为相对测量法用于分析的基础是标准曲线。

当然，如果是绝对测量，那不同仪器测出来的就是相同了。

我的意思简单点说，就是

1.仪器鉴定时，光度准确度其实是单点法。
2.单点法是不准的。
3.但是不同仪器都有相同的吸光度
4.那么仪器一定是根据这些吸光度来设计的。

分光光度计的硬件电路我还是知道的，但是它的软件做了哪些我就搞不清了。
感觉还是没搞清分光的精髓所在。

大约10年前，使用72G和721型，同一溶液用一套比色皿在不同机子上测，吸光度差异可达0.2（0.5-1.0范围内），但是各台机子做出来的标准曲线倒还可以，因此我怀疑机器之间单色性不同或波长不准。还有，这个机器放大倍率可调，同一仪器在不同倍率上测出的A值也不同。这就可能是光电元件的线性不好了，但是标准曲线的线性倒也还可以，也可能是光斑不匀造成的。

后来使用Unico 2100型，看一位老师用同一溶液在10台机器之间的最大测试差异小于0.1，多数小于0.05，应该还算比较好。不过现在仪器用了许多年了，不知还好不好。

仪器分析的实际测试绝大多数是相对测量，样品都是与标样（已知样）对比某一计量值（传感器）的电信号强度。因此即使被测值理论上是绝对值，如A或T，但实际测量时都是采用信号强度相对比较方法的。理论上每台仪器应该在不同波长上测出来的吸光度都一样，但实际上很难做到，高档的应该好些，可能基本一致。

你写的仪器调试单点法可能与一般分析中的单点法是否不同？一般分析中是在一个选定波长下进行；而你说的应该是一个或数个波长下调好吸光度后，交付用户在各个波长下使用。我想这两种情况是不同的。

原文由 tutm 发表:
这个机器放大倍率可调，同一仪器在不同倍率上测出的A值也不同。这就可能是光电元件的线性不好了，但是标准曲线的线性倒也还可以，也可能是光斑不匀造成的。

后来使用Unico 2100型，看一位老师用同一溶液在10台机器之间的最大测试差异小于0.1，多数小于0.05，应该还算比较好。

你写的仪器调试单点法可能与一般分析中的单点法是否不同？一般分析中是在一个选定波长下进行；而你说的应该是一个或数个波长下调好吸光度后

tutm老师和anping老师都很认真，非常敬佩。

做事先做人，以后得多跟tutm老师和anping老师学习。

1."同一仪器在不同倍率上测出的A值也不同。这就可能是光电元件的线性不好",一般放大是在光电检测器后面，所以，我觉得不同倍率对光电元件的线性影响，好像不对。

2.tutm老师，你说的10台仪器是同一厂家，同一型号的仪器，还是不同仪器？

3.你说的“一般分析中是在一个选定波长下进行”，那就是仪器检测光度准确度也是一般在两、三处进行，比如长波处，短波处，中间一处，其实跟选定一个波长也差不多。

我觉得检定光度准确度很像用砝码校准天平。就是用标准滤光片校准吸光度，但是这里的吸光度改变不了。


想想假如没有标准砝码，没法较天平，那是不是也可以测一系列的标准质量，来确定待测物的质量呢？

原文由 tutm 发表:
大约10年前，使用72G和721型，同一溶液用一套比色皿在不同机子上测，吸光度差异可达0.2（0.5-1.0范围内），但是各台机子做出来的标准曲线倒还可以，因此我怀疑机器之间单色性不同或波长不准。还有，这个机器放大倍率可调，同一仪器在不同倍率上测出的A值也不同。这就可能是光电元件的线性不好了，但是标准曲线的线性倒也还可以，也可能是光斑不匀造成的。

后来使用Unico 2100型，看一位老师用同一溶液在10台机器之间的最大测试差异小于0.1，多数小于0.05，应该还算比较好。不过现在仪器用了许多年了，不知还好不好。

仪器分析的实际测试绝大多数是相对测量，样品都是与标样（已知样）对比某一计量值（传感器）的电信号强度。因此即使被测值理论上是绝对值，如A或T，但实际测量时都是采用信号强度相对比较方法的。理论上每台仪器应该在不同波长上测出来的吸光度都一样，但实际上很难做到，高档的应该好些，可能基本一致。

你写的仪器调试单点法可能与一般分析中的单点法是否不同？一般分析中是在一个选定波长下进行；而你说的应该是一个或数个波长下调好吸光度后，交付用户在各个波长下使用。我想这两种情况是不同的。

  首先是要保证校正没有问题,使用的比色皿和操作方法等都没有问题,如果还是有差异,我认为主要是光电转换的线形问题,特别是在光强度差异较大的时候,非线形更明显,斑主说的吸光度为1.8了,光强差异是比较大的,需要做非线形校正就可以了,就看厂家的软件是否支持.