主题：【转帖】载体构建中连接的心得

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发表于：2009/07/01 14:32:04 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

两片段连接

通常是指目的片断和载体片断的连接，包括①小片段（目的片断小于载体片断的大小）和载体片段的连接，这种情况多些，也比较容易连接，按照说明书要求的比例进行即可，比如TAKARA的pMD19-T Simple Vector连接时Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为1 ：2～10即可，如果效果不佳，检测一下感受态细胞，如果片断过小比如几十bp，连接时要加大小片段的摩尔数，多连几管，挑选白斑，以上是指双酶切后的连接，即载体和目的片断俩端的酶切位点相同；②大片段（目的片断与载体片断的大小差不多甚至大于载体的大小）和载体片段的连接，目的片断与载体片断的大小差不多的情况应尽量避免，因为这会给目的片断胶回收带来麻烦，我就遇到过这种情况，胶回收时很是费尽，最后勉强分开，当然换个载体也许就解决问题了。我做过3000多bp和pMD19-T Simple Vector的连接，开始不行，后来成功了，连接率不高，我的经验是如果感受态细胞没问题，那就反复试目的片断和载体片断的连接比例，可以超出此范围1 ：2～10一试。

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2009/7/1 14:33:11 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

片断的连接

做多个片断的连接，首先强调一个问题，那就是大家一定要注意所有片断俩端的酶，把他们的特征要弄得清清楚楚，是否存在同尾酶和同裂酶，多片段同时连接时这个问题就太重要了；多片段连接要总体先规划好了，再开始入手设计引物，否则考虑不周后患无穷啊,呵呵！
①多片断的连接最经常的做法是顺次俩俩连接（目的片断和载体片断的连接），就采用载体上的多克隆位点，注意顺序！如果所选载体多克隆位点上的俩个酶切位点比较近，甚至相邻，最好分步酶切载体，比双酶切效果好的多，经验！接下来的方法和前面的差不多，就是麻烦些
②多片断的同时连接，我最多做过四个片断的同时的连接，当然，其中包括载体片断。做多个片断的同时连接，不得不把我走过的弯路告诉大家！那就是同尾酶的问题，我也是在合成引物后发现的这个问题，我的其中一个片断俩端分别是XhoI和SalI，结果问题来了，酶切后连接时有可能正连也可能反向连接，如果连正了还好，反了就比较郁闷了，根据当时的实验设计，如果想改就得改所有其他片段的引物，硬着头皮来吧！筛吧！一个原则，小片段要量大，多设计几种比例，连吧，挑选白斑，做菌落PCR检测连接情况，想想觉得痛苦，每个板挑几十个白斑做鉴定，大部分假阳性，不过最后还是找到了正确连接的克隆，可是浪费了很多时间和金钱，惨痛的教训！感觉多片断的连接，关键还是片断之间的摩尔比，大胆尝试吧！

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