主题：【讨论】与HPLC色谱柱有关的十大神话

神话五：碳载量越高，反相色谱柱就越好

错误!谈到普通的烷基键合相时，这样的结论看来是对链长、载碳量和表面键合度等概念有误解。通常，对一个真正的反相保留机制来说，保留能力取决于被分析分子的相对疏水性，所以保留一般取决于载碳量。载碳量越高，保留能力越强。载碳量一般与链长成正比，但并不是必然如此。典型的色谱硅胶表面，可用于和有机硅烷试剂键合反应的硅醇含量在8.0 μmol/m²左右。假设在所有的硅醇基上都能实现单层键合，则链长越长，载碳量就越大，结果是保留能力与链长成正比。然而，虽然是短链键合相（比如C8），如果表面键合度相对更高，那么键合的碳就会更多，就会导致可能比C18有更加强的保留能力。此外，一些厂家使用二氯硅烷和三氯硅烷做键合试剂，由于（水平方向硅烷试剂之间的）聚合反应的发生通常能增加固定相的键合率。这种情况下，短链聚合键合相会比长链单体键合相的键合度高很多。对比单体键合相，聚合键合相的键合层较厚，有时会引起传质速度变慢（传质速度慢，柱效就低）。
高载碳量的反相柱更加容易发生相塌陷（或更确切地称固定相失湿）。对于这些柱子，当流动相中有机相比例降到10%以下的时候，疏水性已强到"类油"的固定相之间就会倾向于互相结合（self-associate），而不是处于在极性水溶液中的溶解状态（即相似相溶）。所以，在此情况下，高碳载量反而可能对反相色谱性能有害，而且保留时间的重现性也不好。

很想帮LZ减负，翻译一下。 不过水平不够，太专业了。就一句话谢啦。

plexur 的专业英语很牛，等着另外5个神话。

神话六：小粒径色谱柱的柱效总是相对更高

错误。对于一个装填良好的色谱柱而言，随着所装填的填料平均粒径的减小，柱效提高；但是对于某个特定的HPLC仪器，如果引起峰展宽的柱外效应足够大，小粒径色谱柱的高柱效就不能实现。柱外峰展宽效应由填料本身以外的所有额外的体积引起，它们包括：
1. 进样体积，包括进样环以及进样阀内的额外体积
2. 从进样阀（器）出口到色谱柱入口的管路体积
3. 保护柱内的间隙体积（保护柱如果有柱头，还包括柱头内体积）
4. 在线过滤器内体积
5. 色谱柱入口到色谱填料之间的一段距离的体积，包括筛板孔隙和液流路径的体积
6. 色谱柱内填料颗粒之间的间隙体积
7. 色谱柱色谱填料到出口的一段距离的体积，包括筛板孔隙和液流路径的体积
8. 色谱柱出口到检测器入口的管路体积
9. 检测器入口到流通池的管路体积
10. 检测流通池体积
　　上述均为柱外体积。因此，即便能够做到把进样量最小化，保持色谱柱入口前的管路尽可能短，内径尽可能小,但如果色谱柱出口到检测器的用了内径0.2英寸的管路有1米长，谱带展宽效应就可能会大到影响色谱分离的总体效果。所以，想要在小于2μm粒径填料的色谱柱或者1.0mm内径的 微孔柱上得到期望的分离效率，就要确保把HPLC体系的柱外效应减到最小。

神话七：对于硅胶填料，残留的硅醇基是造成拖尾的原因

错误。在特定条件下，硅胶基质键合柱上存在的硅醇基，尤其是在分析碱性物质时，能够造成峰拖尾。拖尾的原因在于硅醇基团本身就是一个弱酸，pKa大约在4.5和4.7之间。因此如果流动相pH值在4到5的时候，硅醇就会离子化，并与诸如质子化的胺类等带正电荷的分子通过静电引力发生作用。可以通过将pH降到3以下来抑制硅醇基的离子化的方式尽量减小该种作用。但是对于许多碱性化合物，在低pH条件下也能够发生拖尾。有经过特别设计的专门的反相色谱填料，对碱性化合物的测定，能获得好的峰形。
三种原因能够造成拖尾，化学问题（之前已经讨论过部分），柱填充问题，色谱设备硬件问题。三种问题都可以造成拖尾，但是要解决问题，就需要找到问题的根源。详细探究这三种原因超出了本文的范围，这里就三种类型的问题分别举几个实例，使大家有一个大概的认识。首先，除了硅醇基的作用外，化学因素的拖尾还有其它几种方式。与金属产生螯合作用的化合物与色谱填料中的痕量金属作用引起的拖尾，在早期的硅胶基质中特别明显。错误的进样溶剂选择能够导致拖尾，使用比流动相强的溶剂进样也能够导致峰变形失真。样品中不容易洗脱的强保留组分和流动相中的杂质在柱头的逐步累积也可导致拖尾，这些在柱头累积的物质能扮演不同的固定相角色，与经过的分析物作用而导致分析物峰形拖尾。有时，存在混合模式的保留作用也能够诱发拖尾，如分析物与活性基团既有反相作用也有离子相互作用的情况。有时候，流动相pH选择错误，样品部分离子化，分子态和离子态共存，混合模式作用就能够导致峰扭曲和拖尾。此外，一个大的色谱峰后面如恰好有一个洗脱出峰时间相差不大的的小峰，看上去也和拖尾一样。
柱子的填充质量不好也可以导致拖尾。柱头的填料空隙可以导致峰分叉或者拖尾。如果柱子没有填充好，柱床上有微小的沟槽就能够使峰形过宽。进样浓度过大，样品过载也会导致拖尾，样品过载导致峰前延的情况更常见。如果样品进得少了，因为过多的硅醇基存在，也能够导致拖尾。
接下来来讨论下仪器硬件问题导致拖尾的情况。前面说的管路死体积（extracolume）和接头体积能够导致拖尾。进样时的瞬间加压可以造成柱头填料塌陷（有空洞形成）从而引起拖尾。反应比较慢的检测器用来检测快速洗脱出的分析物时会形成峰展宽和拖尾（和流通池厚度，长度有关 译者注）。前文中说的柱操作温度和流动相温度不一致也会引起拖尾。
所以说，造成HPLC拖尾的不总是硅醇基。

神话八：硅胶填料只能够在pH2到7使用　　

通常有两种HPLC反相柱的化学毁坏机理：在低于pH2时,硅氧键的催化水解；在pH大于7或8的时候，硅胶被水中OH^-离子溶解。Kirkland和其合作者对这两种机理做过详细的研究。pH小于2的时候，-Si-O-Si-可以被水合氢离子H3O⁺进攻，固定相就会流失断裂。随着时间的推移，随着载碳量下降保留值会慢慢下降。有三甲基氯硅烷等短链封端的色谱柱，由于封端试剂更易水解流失，这种现象更为明显。长链C18固定相因为空间位阻效应，对于这样一种流失有一定的保护作用，但是最终仍然是慢慢被侵蚀，尤其是温度高于环境时。空间保护、高密度键合有助于防止硅胶键合相的流失。聚合固定相在这种条件下表现良好，但是比起硅胶固定相，其柱效要低。
在高pH方面，一定需要有保护硅胶基体免于氢氧根离子进攻的措施。一旦溶解过程开始，随着柱床内空洞出现，色谱柱会最终失效。所以开发了双硅烷交联C18（bidentate C18）、有机无机杂化颗粒以及聚合物包覆硅胶等耐高pH的特种色谱柱。这些柱子都使用了化学方法来保护固定相避免OH^-的攻击。上述的特种柱子能够承受pH11-12的条件。在此碱性pH条件下，柱子要避免高温使用。当然，聚合物色谱柱能够在pH13甚至14的条件下使用，但是，前文已经指出，聚合物柱比硅胶柱柱效要差些。
因此，在这个论点上，特殊的硅胶柱能够在pH2-7以外的范围使用，但是普通硅胶色谱柱要格外小心，由其是在高温条件下。

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神话九：当代HPLC柱至少应该承受1000次进样

错误。现代HPLC色谱柱能够承受的进样数量由许多因素决定。有些因素基于以下色谱作用的模式不同而不同：反相色谱，离子交换色谱，排阻色谱，正相色谱，手性色谱，亲水交互色谱等等。有些因素基于不同的填料基体：硅胶基质，杂化基质，氧化锆基质，聚合物基质，或者是凝胶和有一定交联度的聚合物树脂。有些因素基于固定相本身的一些特性：表面键合度，键合方式，聚合还是单层键合，或者是聚合物包覆。其他的因素和色谱应用条件有关：pH，温度，流动相组成，缓冲液组成，流动速率，压力等等。还有些和样品有关：完全标样，样品洁净度，样品pH，样品体积（含量），样品杂质，分析物分子本身特性等。
如果一根柱子被滥用，比如在pH范围外，或者流速范围外，很有可能连50次进样都成问题。如果样品里都没有强保留物质，5000次使用也不为过。如果色谱柱不在其承受力上限上连续使用，寿命会更长。如果柱子进样的样品繁杂，但是从来不冲洗除去柱子里的强保留物质，寿命必然减少。
通过对许多制药公司访问得到的经验表明，绝大多数5μm反向色谱柱在分析制剂、简单药品混合物和标样的情况下能够承受至少1000次进样。如果样品“很脏”，比如没有进行过严格完全净化的生物样品提取物和环境样品提取物，1000次进样是问题的。
所以说柱子能够承受的次数不是绝对的，而是取决于柱子的类型，操作条件，样品洁净程度和柱子被滥用程度等。当然，使用保护柱或在线过滤器，柱子的寿命会延长。在很多个专业研讨会上，作者通过对听众合参会者的非正式的投票调查，结果表明：只有不到15%的使用者实际记录了某支特定色谱柱能够用的次数，很多色谱工作者并不真正知道每支色谱柱到底能够使用多少次进样。一些现代的HPLC仪器的软件可以记录或监控进样的次数。

神话十：色谱柱总是应该紧紧的密封，以防被填料因与空气接触而损坏

错误。通常色谱柱两头的微孔的直径不到0.2英寸，所以在如此小的截面积的区域内，空气进入和填料接触以及色谱柱内溶剂蒸发所造成的损伤都十分微小。即使是有部分空气进入色谱柱，也很难扩散通过致密的填料床，接触足够多的填料而造成损害。假若柱子中有了部分空气，只要装在色谱设备上运行一次，在高压下会立即溶解，然后流出色谱柱，不会对后面的使用有任何危害。当然，如果你为了保险，死死的拧紧也行。大部分柱子都配备了带螺纹的柱塞头，手动就能够拧紧，以防止溶剂蒸发，空气进入填料。

关于第十个神话,只是指色谱柱在正常使用的间隙,无需将PEEK堵头死死拧紧,如果色谱柱需要长期存放一段时间,堵头还是需要拧上并拧紧的,溶剂的挥发会导致柱床变干,影响色谱性能。