主题：【资料】色谱100年回顾扎记(共72讲)

色谱100年回顾扎记（2）





            库恩(R. Kuhn) 对液固吸附色谱的贡献

茨维特的试验虽然意义很大，但并没有立即得到当时化学界的重视．经过二十五年后，直到1931年，奥地利化学家R．库恩(Richard Kuhn，1900-1967)等利用和发展了茨维特的色谱法。

类胡萝卜素是一种成分十分复杂的色素，存在于多种植物和动物脂肪中，所以也叫做脂色素。1831年Wackenroder首次分离出类胡萝卜素，是从类胡萝卜中提取出来的一种赤红色结晶，此后又从植物绿叶中分离出类萝卜素。真正分离出单质萝卜素化合物的是库恩，他使用了茨维特的液-固色谱法，用碳酸钙一类吸附剂分离出三种胡萝卜素异构体，即α-胡萝卜素（mp 188℃）, β-胡萝卜素（mp 184℃）,γ-胡萝卜素（mp 178℃）。库恩利用茨维特的液-固色谱法分离了60多种类萝卜素。

库恩把所得到的纯胡萝卜素测定出了它的分子式．同年，他们和芬德史坦(Winterstein)等又扩大液-固吸附色谱法的应用，制取了叶黄素结晶；并从蛋黄中分离出叶黄素；另外还把醃鱼腐败细菌所含的红色类胡萝卜素制成了结晶。从此，吸附色谱法才迅速为各国的科学工作者所注意和应用，促使这种技术不断发展．

库恩镕在应用纤维状氧化铝的时候，曾着重论述了选择吸附剂的重要性，论述了关于吸附剂的制备和活化问题。以后由于在这方面继续工作的结果，发展出了许多具有高度活性和选择性的吸附剂，判明吸附剂的活性和选择性不仅与它们的化学组成有关，而且与制备过程及前处理情况有密切关系。

库恩生于奥地利维也纳。1922年毕业于慕尼黑大学，获哲学博士学位，1926－1929年任苏黎世高等技术学校教授。1929年任凯撒.威廉医学研究所化学部主任。1950年任海德堡大学生物化学教授，1955年任普朗克研究所副所长，是国际化学联合会会员，1938年任副会长。还是海德堡科学院、纽约科学院院士，德国化学会，伦敦化学会，印度化学会，波兰化学会，日本药学与生物化学会会员。

库恩长期研究胡萝卜素化学成分，发现贝塔胡萝卜素由碳、氢二种元素组成，以交替单键和双键延伸排列成哑铃状对称结构。1935年，库恩首次合成核黄素。研究核黄素机制，发同核黄素是一种畏酶，在机体内先与磷酸及腺嘌呤结合，形成复杂结构，后与特殊蛋白质结合，形成一种有催化能力的酶。

1934年，库恩与卡勒合作，合成维生素B2,1937年合成维生素A，1939年，库恩合成维生素B2，并发现其完全化学式。

由于库恩研在究胡萝卜素、核黄素和维生素获得显著成就，1938年获得了诺贝尔化学奖。


我国著名有机化学家汪猷先生在1938年秋去海德堡威廉皇家科学院医学研究院化学研究所，任客座研究员。在库恩指导下进行藏红素化学的研究。合成了十四乙酰藏红素。这是当时分子量最大的有机化合物。

色谱100年回顾扎记（3）

    电泳的创始人蒂塞利乌斯 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 1902～1971

瑞典生物化学家


蒂塞利乌斯1902年8月10日生于斯德哥尔摩,1971年10月29日卒于同地 。他4岁时随家移居哥德堡。1921年入乌普萨拉大学,就读于物理化学家 T.斯韦德贝里 。1924年获化学、物理和数学三个硕士学 位,1930年获博士学位。后任乌普萨拉大学化学讲师、副教授。在此期间曾先后 两次赴美国威斯康星大学和普林斯顿大学从事研究和进修,1938年任教授。同年任新建的生物化学研究所所长。1946年任瑞典全国自然科学研究会主席。1946年 当选为美国科学院外国院士。

蒂塞利乌斯 1925 年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的 电泳 分离研究。曾自制超速离心机测定蛋白质分子的大小和形状,并与斯韦德贝里合作发表了第一篇论文,报道了测定蛋白质淌度的新方法。1930年他进一步改进实验手段和装置,发表了关于色谱法和吸附的论文。1935 年从美国回国后,重新改建原有电泳装置,发展了区带电泳法,大大提高了效率和分辨率。1940年他用自已设计的新电泳装置成功地分离了血清中蛋白质的4个组 分,分别命名为:白蛋白、α、β、和γ球蛋白。该法迅速应用于分离和鉴定各种 复杂蛋白质及其他天然物质的混合物的组成。

他因对电泳分析和吸附方法的研究,特别是发现了血清蛋白的组分而获得1948年诺贝尔化学奖。

由于电泳技术的发展，特别是80年代以后毛细管电泳和阵列毛细管电泳的发展为人类基因组计划的提前完成作出了重要贡献。

色谱100年回顾扎记（4）
分配色谱的创始人马丁Martin (1901～2002)


马丁(1901～2002) 英国分析化学家。1910年3月1日生于伦敦。1932年获剑桥大学学士学位，1936年获博士学位。于2002年7月28日逝世享年92岁。

1938年，马丁的合作者辛格在研究乙酰氨基酸时观察到，这些氨基酸在氯仿和水之间的分配系数明显不同。马丁曾在那以前研制出一种用于维生素纯化的逆流萃取器。他们进行合作尝试在两种逆向流动的溶剂间分配氨基酸以便分离它们，但这没有成功。后来他们发现，如果使水吸附在硅胶上保持水相不动，只许氯仿相流动的话，分配过程就可顺利进行。他们还发现，如果使用甲基橙那样的不溶于氯仿的指示剂，就有可能检测到乙酰氨基酸在柱上的层带。

马丁和辛格因在1941年发明了分配色谱法特别是纸上色谱分析法而共享了1952年诺贝尔化学奖。用这种方法辛格弄清了简单的蛋白质短杆菌肽（Gramicidins）的结构，找出了几种氨基酸在这种分子中的次序。很快就证明，这项工作对于F·桑格阐明在胰岛素分子中氨基酸的排列次序有巨大作用。

James和Martin 1952年所作的气液色层分析在分析，在化学上开辟了一个新的园地，无论在研究和工业上它都有广泛应用的前途。并在色谱法的理论作出了卓越的贡献

色谱100年回顾扎记（5）

        分配色谱的创始人之一辛格（R L M Synge）

                      (1914-1994)


1941年6月英国生物化学会在伦敦第214次会议上，A.J.P. Martin 和 R.L.M. Synge 两个年轻化学家（Martin 31岁，Synge 26岁）发表了一种新的方法分离羊毛中的氨基酸的论文，此后这一报告在生物化学杂志上发表，即分配色谱的诞生日（A.J.P. Martin and R.L.M. Synge, Biochem. J. 1941，35：91 ）

  Martin 和Synge 都是英国剑桥大学的毕业（Martin在1932年，Synge 在1936年毕业），之后他们都在剑桥读研究生。之后Martin 和Synge 同在英国里兹的羊毛工业研究协会从事羊毛的研究，开发了用液-液分配色谱，他们用硅胶吸附的水作固定相，以氯仿作流动相，分离羊毛中的氨基酸。为此获得了1952年诺贝尔化学奖。

  R. L. M. Synge (辛格)1914年10月28日出生于英国英格兰西部港口城市利物浦，1933年进入剑桥大学三位一体学院（学习物理、化学和生理学），1936-1939年间在该校生物化学实验室做研究生。1939-1941 间在英格兰北部城市利兹的 Wool Industries Research Association （羊毛工业研究协会）做研究工作，1941年获剑桥大学的博士学位。同年在到Wool Industries Research Association 工作，1943 到伦敦的Lister Institute of Preventive Medicine（利斯特预防医学研究所）做生物化学方面的研究。从 1948 年以后他成为苏格兰阿伯丁Rowett Research Institute 蛋白质化学部的主任。1950 年成为英国皇家学会成员，1952. 成为英国皇家化学研究所成员。他是美国生物化学会荣誉会员。1994年逝世。

色谱100年回顾扎记（6）

      氨基酸自动分析仪发明人


S. 穆尔 (Stanford Moore)  （1913--1982）


W. H. 斯坦 (William Howard Stein) （1911--1980）

美国生物化学家斯坦福·穆尔，由于利用定量分析的方法解决了有关氨基酸、多肽、蛋白质等复杂的生物化学问题；由于对胰腺的核糖核酸酶的研究使酶化学得以进一步发展，与纽约洛克菲勒大学的威廉·霍华德·斯坦博士及美国国立保健研究院的克里斯廷·狡默·安芬森博士共同荣获了一九七二年的诺贝尔化学 斯坦与穆尔先后研制发朗了氮基酸自动分析仪含有磷酸盐的聚苯乙烯色谱柱自动分折仪和氮基酸自动程序分析仪，为蛋白质的田定和研究作出了重大贡献。

斯坦福，穆尔是美国有机化学家兼生物化学家，1913年9月4日生于伊利诺斯州芝加哥，年轻时曾就谈于范德毕尔持(Vanderbilt)大学和威斯康辛大学，1934年获得理学士学位，接着又攻读博士学位，于1938年获得有机化学的哲学博士学位。1939年起到纽约洛克菲勒医学研究所工作，不久该所就合并入洛克非勒大学医学院．穆尔转到学校担任教，t952年升为该校生物化学教授，并成为洛克菲勒研究基金会的正式成员。穆尔早期的研究工作比较偏重于有机化学基础理论，主要研究碳氢化合物的特性和反应机理等问题，后来随着工作的变动．逐渐转向生物化学和医学，特别是对生物机体内酶的功能和作用寄予很大的关注并把这一工作与探索遗传性疾病的起因联系起来。

基于达一目的他从四十年代中期起，就与另一位生物化学家斯坦合作，着手对细胞内核糖核酸酶的结构进行分析和测定。这是一项十分艰巨的工作，因为这种酶的分子虽很大，结构也特别复杂。当时人们对蛋白质的结构形态虽然已经有了基本的了解，但是要精确地确定蛋白质分子极其庞大而又精细的结构和组成成分，还缺乏有效的办法。

五十年代初，穆尔曾以洛克菲勒基金会成员和教授的身份到西欧一些国家进行学术访问和讲学等活动，在此期间还应邀访问了比利时布鲁塞尔大学和英团剑桥大学等几个研究生物化学和分子生物学的著名机构，特别在剑桥获悉桑格在测定胰岛素分子结构方面取得的近辰，从中得到某些有益的启示．于是他就和斯坦一起尝试用桑格的方法进行试验，但在试验过程中他们发观尽管桑格使用的方法用于测定胰岛素一类蛋白质的结构非常有效，但用来测定核糖核酸酶这样的分子仍然有很多困难。因为胰岛家只台有51个氨基酸，其分子量为5734，是一类比较小的蛋白质分子，而核糖核酸酶分子的分子量至少要超过它一倍以上。因此他们得出一个结论，要测定分子量达一万以上的蛋白质的结构，就必须要有更精确的分折方法，于是穆尔和斯坦就着手对桑格使用过的纸色谱法(亦称纸色层分析法，这种方法最早是由英国化学家马丁等人首先发明的，桑格曾用这种方法与他自己发明的“桑格试剂”结合起电于1954年成功地测定了胰岛责的分子结构)进行研究改进，经过不断地摸索，创造出一种用离子交换树脂来分离各种氨基酸的新的方法，称为“氨基酸柱色谱法”，用这种方法可以更有效地分离蛋白质中的氨基酸，并定量地测出它们所含的成分。不久他们就创成了第一台“氨基酸自动分析仪”，这种仪器不仅可以用来分析鉴定氨基酸，还可以用来分析鉴定肽，现已成为研究蛋白质化学不可缺少的仪器。

穆尔和斯坦用这种方法，于1960年非常成功地测定了牛胰核糖核酸酸酶A(这种核糖核酸酶是从牛的胰脏细胞中取得)的一级结构，包括它的全部124个氨基酸的排列顺序，和组成这些氨基酸的总共1876个原子的精确的位置，这一杰出成就为测定其他各种酶和蛋白质分子的结构开辟了崭新的道路。此外，穆尔还在研究蛋白质的生物合成过程中，弄清了有关酶的活性、酶与底物作用的机理等许多重要问题，特别是阐明了在这一过程中由于DNA分子的损伤而引起的蛋白质结构和排列顺序上的错乱，是造成某些生理性缺陷和精神病症的根源，以及某些特殊性质的酶具有修复这种损伤的能力。他的工作着重表明了酶和蛋白质的研究对于防止疾病的关系，对发展分子生物学和遗传工程的研究作出了贡献。由于他的工作具有开创性意义，于1972年获得了诺贝尔奖金。

1973年，在洛克菲勒大学为他和斯坦共同获奖而召开的一次记者招待会上，穆尔声称：  “到目前为止，虽然被阐明的酶还仅仅只有20多种，但可以预期，到本世纪末，将至少有二千种以上的酶被人们发现相阐明。”这一预言已为近年来事实的发展所证实。

他的著作备《关于碳氢化合物的特性》以及有关测定氨基酸和各种酶、蛋白质分子结构，和阐述色谱分离技术的许多论文和著述。

  （文献：扬成章司徒志雄编译：“诺贝尔化学奖金获得者”1985）

色谱100年回顾扎记（7）

    纸色谱的问世和贡献

Martin 和 Synge 在研究分配色谱时，所使用的色谱柱不能用于二元羧酸的分离，因为硅胶填料只起到承载吸附水的功能，所以他们考虑使用其他材料做载体，于是首先想到使用纸作载体。

他们知道染料化学家使用纸检查染料的纯度是使用的滤纸，但是他们没有叫做纸色谱，Martin 和Synge 试验这种技术，把一滴两种氨基酸溶液滴到浸润了水的滤纸（固定相）上，然后用丁醇（流动相）利用毛细管作用移动到滤纸上，逐渐移动到边缘，两种氨基酸以不同的速度移动。同时加入他们研究组的A.H. Gordon 研究了和氨基酸产生颜色化合物的试剂，他从Beilstein’s Handbuch der Organischen Chemie （拜尔斯登有机化学手册）上找到茚三酮，使纸上的氨基酸显色，此后他们开发出一种适合于纸色谱的方法，把纸条放到一个密闭的盛有水容器中，其中空气用水蒸汽饱和，纸条一头浸入流动相中，这就是现在的纸色谱方法。得到初步成功之后，他们试验了各种溶剂来分离各种混合物，但是没有一种单一溶剂可以分离所有常见的氨基酸混合物，后来他们就试验使用现在称做“双向色谱”的方法，即在一个方向展开以后，把纸条旋转90° 再用不同的洗脱剂再展开一次。

Synge 在分享了有关分配色谱和纸色谱的研究之后， 在 1943 年离开研究组。

研究纸色谱的三位科学家 Martin, Gordon, and R. Consden （后者是以为年轻的化学家此时参与这一研究）发表了纸色谱的主要研究报告，在1944 年 3 月 25 日的生物化学会年会上发表，之后又在杂志上发表：

R. Consden, A.H. Gordon, and A.J.P. Martin,  Biochem. J. 1944，38：224–232 

这一经典性研究代表了纸色谱的开始，此后纸色谱很快被人们接受，发展很快，这是因为这一方法非常简单，滤纸在任何一个实验室都有。W.J. Whelan （1937 年诺贝尔化学奖得主N. Haworth 的学生）很好地说明了纸色谱对生物化学和分子生物学研究所起的作用。他强调纸色谱可以在很短的时间内分离氨基酸和糖类。

Synge 虽然离开了Martin, Gordon 的研究组，但是他还是利用纸色谱分离肽水解之后的氨基酸，这一工作为 F. Sanger 研究胰岛素全部肽的排序作出贡献，F. Sanger 由此而获得了1938年的诺贝尔化学奖。

色谱100年回顾扎记（8）

      气-液色谱的问世


Martin 和 Synge 在 1941 年研究液-液分配色谱时就提出可以使用气体作流动相，即气-液分配色谱,他们在 1941 年的著名论文中写到”流动相不一定是液体，也可以是蒸汽……因而以永久性气体带动挥发性混合物,在色谱柱中装有浸透不挥发性溶剂的固体通过时,可以得到很好的分离”。但是气-液分配色谱直到十年以后才变为现实。所以如此，第一是因为 1941 年爆发了第二次世界大战，英国处于困难时期，这一时期很少国家能得到英国出版的期刊，当时欧洲大陆在德国法西斯统治之下，甚至在 1941–1945 年间的期刊也都埋没在图书馆里，无人问津，所于Martin 和 Synge 的论文和先进的观点没有被人们注意。第二是因为当科学研究和通讯交流恢复以后，在 20 世纪 40 年代末纸色谱引起人们的极大兴趣，无人顾及 Martin 和 Synge 1941 年的论文。第三是因为当时一些物理化学家（主要是德国）认为气体的纵向扩散十分快速，致使混合物难以在介质中得到分离。

    一直到 1950 年 Martin 最后证实自己预言的正确。Martin 于 1950 到国家医学研究所，他邀请年青科学家 A.T. James 参加他的研究，用气体做流动相的气-液分配色谱，促使他们进行这一研究的是有人提出是否有比纸色谱更好的办法，对脂肪酸进行精细分离，他们使用硅藻土助滤剂（Celite）做载体，用硅油固定相，用气体流动相,这就是气-液分配色谱了，把色谱柱末端浸入有指示剂的溶液中，分离出来脂肪酸的量用滴定法测定。但是不久 Martin 就研究出一种自动滴定的仪器来。后来知道对高沸点化合物，必须把色谱柱加热才行，于是就在色谱柱外面加一个蒸汽套。他们的这一研究在 1950 年的生物化学学会上以“气-液色谱“为题作了报告。这一报告在1951 年 6 月 日递交到生物化学杂志。以后的几个月他们连续有两篇论文发表，用 GLC 分离氨和脂肪胺，和吡啶同系物，GLC 立即对分析化学产生了极大的影响。当时在石油和石油化工的分析中，传统的分析方法无能为力时，GLC就像及时雨一样，成为无与伦比的得力助手，一直到现在，GC 仍然是最为有效的方法之一。

资料来源：Leslie S. Ettre ， LCGC， 2001，19（5）：506

色谱100年回顾扎记（9）

气-液色谱的发展——gc 国际会议的出现



A.J.P. Martin 和 A.T. James 开发的汽-液色谱的报告首先在 1950 年 10 月20 日的 290 届英国生物化学学会上作了介绍,后来在 1951 连续提交了三篇有关用 gc 分离低碳数脂肪酸、挥发性胺和吡啶类同系物的报告，发表在1952 年的 Biochemical Journal上。( A.T. James and A.J.P. Martin, Biochem. J. 1952, 50: 679–690；  A.T. James, A.J.P. Martin, and G.M. Smith, Biochem. J. 1952,52 : 238–242 ；  A.T. James, Biochem. J. 1952, 52,: 242–247 )。Martin 在成功地分离了这些和生物化学有关的化合物之后就想扩大其应用范围，分离一些挥发性物质，烃类物质是首先考虑的一类化合物，但是 Martin 的工作单位是英国国家医学研究所（伦敦），显然不可能有这类纯物质。1952 年初 Martin 给当时的英国石油公司负责人 S.F. Birch 写信要一些烃类样品，S.F. Birch 就指派 Denis H. Desty 去了解 Martin 为何需要这些样品，Desty 了解了 Martin 研究组的工作之后立刻认识到 gc 对石油化学家的重要意义，Desty 也就成为 gc 的积极倡导者。同时在 1952 年 9 月 4–9 于牛津召开了第一次国际分析化学会议，在会议上 Martin 介绍了有关汽-液色谱的技术，Shell Research Laboratories (Amsterdam) 的 H.Boer 说这是一个历史性的报告。这次会议有来自 26 个国家 700 多人参加，与会者回去以后为此新技术激动不已。首先积极使用 gc 的实验室是石油公司和英国的 Imperial Chemical Industries (ICI)。实际上 ICI 的化学家在阅读 James 和 Martin 的论文以前就访问了Martin 的实验室，不久 ICI 的化学家写出了多篇应用 gc 的论文（F.R. Cropper and A. Heywood, Nature (London) 1953， 172：1101–1102 ；  N.H. Ray, J. Appl. Chem. 1954， 4：21–25 ；  N.H. Ray, J. Appl. Chem. 1954， 4：82–85 ；  B.W. Bradford, D. Harvey, and D.E. Chalkey,J. Inst. Petrol. 1955，41：80–91 ），为 gc 在石油分析中的应用开拓的道路。于是在 1955 年 10 月在英国的 Ardeer 由 ICI’s Nobel division主办的分析化学学会非正式会议，讨论 gc 的各方面的问题，与会者认为 gc 发展十分迅速有必要召开大型国际会议，以便促进 gc 的进一步发展。这一次 会议纪要由英国的 Hydrocarbon Research Group 承担，于 1956 年 6 月召开了这次国际会议。会后成立了一个新的组织——Gas Chromatography Discussion Group——，并决定在两年以后在阿姆斯特丹召开类似的 gc 会议。此后这一组织（后来叫做色谱学会，Chromatographic Society）举行每两年一次的色谱会议。24th International Symposium on Chromatography （24 届的色谱会议）于 2002 年在德国 Leipzig 举行。

（来源 ： LC-gc NORTH AMERICA，2003， 21（2）： 144）

色谱100年回顾扎记（10）

反相色谱的出现

在 1948 年 分配色谱的创始人 Martin 进入  Medical Research Council 工作，起初在 Lister Institute ，后来到伦敦的 National Institute for Medical Research 做究工作，当时他想使用液相色谱分离长链脂肪酸，但是现有的方法是使用极性固定相，并以非极性的剂作洗脱剂 ( 即现在所说的正相色谱 )，得不到好的结果。所以 Martin 就开始研究不同的两相系统，例如使用弱极性的固定相，实验了各种可能性，但是还是不满意：也就是要找到一种理想的疏水性载体做固定相。最后找到用二氯二甲基硅烷蒸汽来处理硅藻土的产物，这一物质不会被极性溶剂所湿润。利用这种固定相作色谱柱及相应分离体系，可以分离脂肪酸。于是在 1949 年就产生了所谓“反相液相色谱” （Reversedphase  $$lc ）并首先用这种方法分离了月桂酸 ( C12 ) 到 硬脂酸 ( C18 ) 的脂肪酸系列。

但在后来的 20 多年里这种广泛使用的反相液相色由于缺少适当的固定相，并对这一物理化学现象理解不深阻碍了这一方法的发展。但是在 70 年代上半段情况发生了很大的变化，即解决了反相液相色谱固定相的制备，使反相液相色谱成为液相色谱中主导的方法。

(L. S. Ettre, $$lc-GC, 2001,19(5): 506)

色谱100年回顾扎记（11）

毛细管气相色谱的出现和发展(1)



色谱柱的校效，一直是研究色谱的一个极为重要的研究课题，从茨维持，马丁 (Martin) 辛格 (Synge)，柯尔曼 (Keulemans) 等都在为提高色谱柱的柱效进行了不懈的研究。毛细管柱的创始人高雷 (M．L. E．Go1ay) 从1955年开始也在当时的Perkin-E1mer公司从事提高色谱柱的柱效方面的研究。

高雷认为一支理想的色谱要比填充柱 (用Celite做载体) 的性能高一万倍，因此他认为理论和实际之间存在很大的差距，所以大有改进的余地。而开管柱（毛细管柱）却可大大改进分离性能，比填充柱可提高约一百倍。

高雷在1957年由美国仪器学会在美国密执安大学举行的第一届气相色谱会议上，发表了第一篇有关毛细管气相色谱的报告 。此时他的理论方面的研究还有些粗略，但是他介绍的一张色谱图，是在一支91m长的色谱柱上得到12000块理论塔板数。这样的水平现在看起来当然是不值一提了，但在当时毕毕竟是一个难能可贵的开始。在此后的一段时间里，高雷和他的同事 (主要是R.D.Codon) 研究了毛细管柱的制备问题，并把他的毛细管柱色谱理论进一步完善。于是在1958年的阿姆斯特丹国际气相色谱会议上，提出了著名的高雷方程，阐述了各种参数对柱性能的影响。另外，他还发表了两幅色谱图，其中一幅是在一支45m长内径为0.25mm 的不锈钢毛细管柱中涂以邻苯二甲酸二(十八酯)，柱效达50000多块理论塔板数，检测器是用高雷自己设计的微型热导池。在58 min 内可以把间-二甲苯相对-二甲苯分离开。柱温70℃，载气为氦，流速为0.48mL／mL，间-、对-二甲苯的相对保留值只有1．023。

(RFU)