主题：【资料】顶空气相色谱系列讲座(140讲)

非常好的讲座,怕打断老师讲课,
我代表筒子们谢谢 YHL-87_

顶空气相色谱系列讲座（22）

用HS/GC/FID和HS/GC/MS定量分析

尸体内脏中微量来苏尔-定量



三、    苏尔定量分析（邻苯甲酚）



顶空色谱法用正丁醇为内标，只定量分析邻苯甲酚，分析结果：1. 甲醇  2. 正丁醇 3. 苯酚  4. 邻苯甲酚  5. 间、对苯甲酚  6. 2,6苯二甲酚  7. 2,5、2,4苯二甲酚  8. 2,3苯二甲酚（见图-9）用内标法分别计算死者各脏器组织中邻苯甲酚的含量。含量顺序为胃内容 > 胃组织 > 肺组织 > 肾组织 > 心组织，再换算出来苏尔的含量（见表-2）

顶空气相色谱系列讲座（23） 

用HS/GC/FID和HS/GC/MS定量分析

尸体内脏中微量来苏尔-讨论



四、体内来苏尔分析的讨论

1.      用内标法对比例恒定的多组分混合物进行定量有两种情况：⑴ 对某一成分定量（本文对邻苯甲酚定量），适用于纯品品种少的情况。 ⑵ 对各主要成分定量，适用于研究多组分之间的比例关系。但要求各单一组分均有纯品做标样。本文所述两种方法对上述两种情况均适用



2. 本法选用了两 种内标（正丁醇和异戊醇），在配制来苏尔或其某一组成成分时均需加入少量甲醇以防乳化。从色谱图上看，甲醇对正丁醇稍有干扰，异戊醇与甲醇的分离优于正丁醇。如选择一个在2~3号峰之间出峰的内标物效果就更好。



3 顶空色谱法检材用量以0.5~1.0g为宜。本文所用样品均偏多，易造成气-固平衡时间长、被测气体的空间偏小、在相同瓶压下含量偏低的情况。



4. 用色-质联用仪进行分析时，在无纯品对照的情况下辨别化合物的异构体尚有困难，如图10中的6、7、8号峰，即是标样来苏尔的213、243、260号峰。死者胃内容中的140、149、154号峰均为苯二甲酚的异构体。

顶空气相色谱系列讲座（23） 

用HS/GC/FID和HS/GC/MS定量分析

尸体内脏中微量来苏尔-讨论



四、体内来苏尔分析的讨论

1.      用内标法对比例恒定的多组分混合物进行定量有两种情况：⑴ 对某一成分定量（本文对邻苯甲酚定量），适用于纯品品种少的情况。 ⑵ 对各主要成分定量，适用于研究多组分之间的比例关系。但要求各单一组分均有纯品做标样。本文所述两种方法对上述两种情况均适用



2. 本法选用了两 种内标（正丁醇和异戊醇），在配制来苏尔或其某一组成成分时均需加入少量甲醇以防乳化。从色谱图上看，甲醇对正丁醇稍有干扰，异戊醇与甲醇的分离优于正丁醇。如选择一个在2~3号峰之间出峰的内标物效果就更好。



3 顶空色谱法检材用量以0.5~1.0g为宜。本文所用样品均偏多，易造成气-固平衡时间长、被测气体的空间偏小、在相同瓶压下含量偏低的情况。



4. 用色-质联用仪进行分析时，在无纯品对照的情况下辨别化合物的异构体尚有困难，如图10中的6、7、8号峰，即是标样来苏尔的213、243、260号峰。死者胃内容中的140、149、154号峰均为苯二甲酚的异构体。

顶空气相色谱系列讲座（24） 


尸体内脏中微量来苏尔的

GC/FID和GC/MS多种定量分析方法摘录-1



用有机溶剂提取或固相提取分离比较简单，也有用蒸馏法分离检测，现在用固相微萃取的方法应更先进。尿中的酚类化合物有相当部分以硫酸酯或葡萄糖醛酸苷的形式存在，，在酸性条件下蒸馏可以破坏结合态。用有机溶剂提取或固相提取分离时，也需加酸或酶对结合态进行水解。下面介绍几种色谱条件和检测方法供参考。



1、 取死者血液2~3ml用乙酸乙酯提取、浓缩至小体积后取1~2μl进样分析。用FID检测器，Chromosorb101(80~100M)1.8m×4mm玻璃柱，柱温210℃，载气高纯氮流速为35ml/min，血中检出限为0.1μg/ml，10μg/ml血添加酚回收率为99%。



2、 取检材进行蒸馏，馏液酸化后用乙醚提取，提取液挥干，再用1~2ml丙酮溶解，进样2~5μl，用FID检测器，25%DC-500/Chromosorb W (80~100M) 2.6m×3mm1不锈钢柱，柱温160℃，载气高纯氮流速为40ml/min，保留时间：酚5.5min、邻甲酚7.5min、间甲酚8.2min、对甲酚8.8min。用标准曲线法求出检材含量



3、 取尿10ml，加入3ml浓硫酸室温进行水解，水解液用特丁基甲基醚提取，提取液2μl进样分析，用FID检测器，10%SP-1240 DA/Supelcoport（100~200M）1.5m×1.5mm玻璃柱，柱温100℃，载气高纯氮流速为42ml/min，用标准曲线法求出检材含量，线性范围10~1000μg/ml。



4、 取血清或尿加入内标物2-氯苯酚，加磷酸进行水解煮沸30min，用己烷提取水解液，己烷液再用碳酸钾溶液反提，反提液酸化后加入乙酸进行酯化，生成的酯用己烷提取，将提取液浓缩至小体积进气相色谱分析。使用FID检测器、3%SP-2250（2m×3mm）玻璃填充柱。内标标准曲线法求出检材含量，酚的检出限为0.6μg/ml

顶空气相色谱系列讲座（25）-1氰化物中毒检验 

氰化物中毒的检验方法-1



氰化物是指含氰基的化合物，常见剧毒或高毒的无机氰化物有氢氰酸、氰化钠和氰化钾，有机氰化物有丙烯腈、双异氰酸盐等，某些植物如苦杏仁、木薯中的氰甙经水解能释放出氢氰酸。

氰化物误中毒或投毒杀害牲口的案件时有发生，多发生在能随手拿到氰化物的行业或对剧毒物品管理不严的单位，如采矿、电镀、冶炼、清洗等冶金行业、化工行业和五金行业。

氰化物和氢氰酸可经呼吸道、消化道及皮肤进入体内，很快被吸收后以氢氰酸和氰离子的形式存于组织和体液中，常利用氢氰酸易挥发性进行分析，使用气相色谱、顶空气相色谱和顶空固相微萃取气相色谱法分析。



一、            氰化物中毒的体内过程

氰化物中毒致死者内脏含量分布规律，血和脾最高，其次是肺、肝、肾、脑、尿等，血中氰化物主要与血红蛋白结合成氰化血红蛋白而存在于红血球中，血清或血浆中含量较少，全血中氰化物的含量约为血浆的4~8倍。

进入体内的氰化物小部分以原形从呼出气、尿、粪中排出；部分在肝内通过硫氰酸酶作用，使氰与巯基结合形成硫氰酸盐从肾排出。硫氰酸盐的毒性是氰化物的1/200，所以氰与巯基结合形成硫氰酸盐是体内最主要的解毒途径。有机氰化物必须先从分子中脱下氰离子后才能转变为硫氰酸盐。小部分氰化物在体内可生成氰钴氨素，参与维生素B12代谢，或被氧化为二氧化碳和氨从呼出气排出；氰基尚可与葡萄糖结合成低毒或无毒的腈类；此外，氰基可转化为甲酸盐，进一步参与碳水化合物的代谢。研究结果表明，氰化物的半衰期为30min~60min；人静脉注入氢氰酸后的代谢速率为0.017ng/kg·min。动物实验表 明，氰离子1.7%随呼气排出，10%以氢氰酸形式排出，近90%转化为二氧化碳。

顶空气相色谱系列讲座（26）-2氰化物中毒检验 

氰化物中毒的检验方法-毒理与症状



二、氰化物中毒的毒理作用与中毒症状

氰化物的毒性作用取决于在体内代谢过程中释放氰离子的速度和数量，氰离子能抑制体内40多种酶，其中以细胞色素氧化酶最为敏感；氰根还可使含巯基或硫的酶类失活。氰化物通过与氧化型细胞色素氧化酶中的三价铁结合，形成氧化高铁型细胞色素氧化酶，阻止它的还原作用，失去传递电子的能力，使组织细胞不能利用氧，引起细胞内缺氧窒息而死亡。此时血中氧不被利用，静脉血中氧含量与动脉血一样高，均呈鲜红色。氰离子能迅速进入所有组织，并很快使神经和肌肉丧失电子传递作用。由于中枢神经系统对缺氧最敏感，故脑组织最先受损。氰化物致死的主要原因是中枢性呼吸衰竭。

氰化物与氢氰酸是剧毒无机物，对生物体作用迅速，中毒发作快，死亡也快往往来不及抢救。当吸入或口服量大时，在10s~60s之间突然发生昏倒、呼吸困难、出现强直性或阵发性痉挛，2min~3min内停止呼吸，继“闪电样”死亡。当吸入与口服剂量小时，则出现咽喉紧缩感、口腔麻木、流涎、剧烈头痛、胸闷、心悸、呼吸困难、眼球突出、最后痉挛昏倒、呼吸麻痹一般在10min~30min之间发生死亡。当食用含氰甙的植物而中毒的症状出现比较慢，潜伏期可达3h~6h，症状比较轻，一般出现呕吐、头晕、嗜睡，重的也只有昏迷、痉挛等，也能引起死亡。具体情况取决于血中氰化物的浓度。

中毒症状与血中氰化物浓度关系表

血中氰化物(μg/ml)          中毒症状

0.5                          皮肤粘膜潮红、心动过速、头痛、头晕、神志清醒

1.0~2.5                  严重头痛、呼吸急促、心动过速

> 2.5          反应    >2.5            反应消失、血压降低、皮肤粘膜青紫、心动过速、

                                  呼吸缓慢、眼球突出、瞳 孔放大、心跳停止死亡   





中毒者的血液、尸斑均呈鲜红色，各脏器一般表现为窒息，肺和脑均有水肿。当氢氰酸或苦杏仁中毒则体内和胃内有苦杏仁气味，当氰化钠（钾）中毒，胃内常出现特殊的碱味。

顶空气相色谱系列讲座（27）-3氰化物中毒检验 

氰化物中毒的检验方法-化学检验



在酸性条件下的氰化物不稳定，易挥发、分解，所以这类案件发生时应及时进行检验。对腐败检材中氰化物的检出时限，取决于氰化物的量和检材腐败程度。如尸体保存得好，一般在中毒后9日~10日内可检出，如保存效果不好检材腐败严重，2日~3日就不易检出。也有因自然条件好，尸体未腐败，死亡半年多仍能检出的个例。

口服中毒以剩余食物、呕吐物、胃内容物为主要检材。如经皮肤、粘膜吸收或注射中毒，则应取血、肝、肺和注射部位肌肉为主要检材。如发现可疑晶体、粉末和纸片，可将其溶于水中，取其水溶液或水浸液进行检验。



三、氰化物中毒的化学检验方法

1.      氰离子的检验

原理——在碱性条件下，氰离子与亚铁离子反应生成无色的氰化亚铁络离子，在酸性条件下，该氰化亚铁络离子与铁离子进一步生成蓝色的亚铁氰化铁,又名普鲁士蓝。灵敏度为0.1μg ~10μg。

操作——取脏器检材3~5g，剪碎后转三角烧瓶中，加水使其呈粥状，再加2mol/L HCl约2ml使呈酸性，立即在瓶口塞上带有玻璃法兰盘（法兰盘中间夹有硫酸亚铁-氢氧化钠试纸）的橡皮塞，法兰盘后接抽气泵，20min后取下硫酸亚铁-氢氧化钠试纸，浸入稀HCL中，如有氰离子存在，试纸则显蓝色斑点。对腐败检材需在硫酸亚铁-氢氧化钠试纸前塞些醋酸铅棉花，防止可能产生的硫化氢而干扰。

硫酸亚铁-氢氧化钠试纸临用时制备，用新配的20%FeSO­4 1~2滴+1~2滴10%NaOH于滤纸上，稍晾干即可用。



2.      硫氰酸盐和氰络盐的检验

硫氰酸盐和氰络盐在酸性条件下受热均可分解产生氰离子，由于氰离子快速检验时均使用酸，因此检出的氰离子有可能为硫氰酸盐和氰络盐所产生，必要时应确认检材中是否含有硫氰酸盐和氰络盐。可取检液数滴酸化后加1%FeCl3 1~2滴如显蓝色，示有亚铁氰化物存在；如显红色，示有硫氰酸盐存在。



3.      硫氰酸盐或氰络盐存在时氰离子的检验

当已检出硫氰酸盐或氰络盐时欲确定检材中是否还含有氰离子，可在检材中

加入碳酸氢钠溶液进行蒸馏（在弱碱条件下前两种盐不分解），取馏液用普鲁士蓝反应进行检验，也可取检材加碳酸氢钠溶液加热煮沸，用硫酸亚铁-氢氧化钠试纸进行快速检验。



4. 含氰甙类的检验

    以氰甙类形式广泛存在某些植物中（包括苦杏仁甙和木薯毒甙），如杏、桃、李、枇杷、苹果等，都可在一定条件下被酸或共存的酶水解，再用普鲁士蓝法检验释放出的氰氢酸。

顶空气相色谱系列讲座（28）4氰化物中毒检验 

 
氰化物中毒的检验方法- SPME/GC和HS/GC



四、 固相微萃取-气相色谱法检验（HS/SPME/GC）

取血液1ml置12ml体积的样品瓶中，加入内标物乙腈和固体硫酸钠后密封，用带有Carbowax/DVB纤维头的固相微萃取针（SPME），在50℃下萃取45min，取出SPME针，再进入气相色谱进样口，在200℃下解吸1min。

气相色谱条件：色谱柱为Supelco-Plot Q 2m×2mm，柱温为110℃，进口温为200℃，检测器（NPD）温为250℃，载气N2为20ml/min。

线性范围0.04μg/ml~4.0μg/ml，检出限为20ng/ml。



五、 顶空气相色谱法（HS/GC）

①  HS/GC/ECD

生物样品中的HCN与氯胺T反应生成氯化氰（CNCl）气体，用ECD检测器进行分析。本方法可使氢氰酸的挥发过程与氯胺T的反应同步进行，因而既快速又专一，不受氰络盐和硫氰酸盐的干扰。

操作——取已经稀释20倍后的血液5ml，转入带一内管的顶空玻璃瓶中，加100μl磷酸，混匀后在顶空瓶的内管（见图1）中加入1ml 0.5%氯胺T水溶液，立即加盖密封，在65℃下平衡90min，取上层气体进行GC/ECD分析。

色谱条件1——用 Cp·sil8B甲基硅烷化的熔融毛细管柱50m×0.25mm，柱温为60℃，检测器（ECD）温为300℃。

方法检测限为5μg/L，在5~1000μg/L范围内呈线性关系。

色谱条件2——RT-Q-Plot 胶粘色谱柱30m×0.53mm×1.2μm，柱温为 110℃，进口温为260℃，检测器（ECD）温为320℃，载气（N2）3ml/min。添加纯品衍生物在4.4min出峰。（见图2）

顶空气相色谱系列讲座（29）-5氰化物中毒检验


氰化物中毒的检验方法-HS/GC分析



前面介绍了气相色谱法中的顶空固相微萃取法（HS/SPME/GC）、顶空气相色谱法（HS/GC/ECD、），下面介绍顶空气相色谱法中的另二种（HS/GC/NPD、HS/GC/FID）和氰化物经衍生后的气相色谱法



五、  顶空气相色谱法检验（HS/GC）

②      HS/GC/NPD

操作——取0.5ml检血于顶空瓶中，加入0.5ml含0.9%NaCl生理盐水后密

封，用针注入0.2ml 50%磷酸，摇匀后50℃下保温30min，抽取0.5ml顶空气进入气相色谱仪进样口。

色谱条件-1——GS-Q毛细管柱 30m×0.32mm ，初温110℃保留4min，

以10℃/min升至160℃，进口温为200℃，检测器（NPD）温为250℃。

色谱条件-2——Porapak Q填充柱 （100~200M）1.8m×2mm，柱温为110

℃，进口温为160℃，检测器（NPD）温为210℃。线性范围：0.25μg/ml~15μg/ml，检测限为50ng/ml。

③      HS/GC/FID

取0.5ml血液于顶空瓶中，加入0.6ml 10%硫酸，立即加盖密封，在60℃下加热平衡30min，取0.5ml顶空气体进入色谱仪进行定量分析，用1.5m×3mm玻璃填充柱，内填有Porapak Q担体，柱温为 120℃，检测器（FID）和进样口温为150℃，载气N2流速为 60mi/min。



六、衍生物气相色谱法（GC）

多采用氰离子与卤化剂反应衍生化为卤化氰；也有与甲醛或乙醛反应衍生化为氰醇；还有与苯胺的重氮盐反应衍生化为苯甲腈。进一步提取直接分析衍生物而定量氰离子的方法。

①    操作——在试管中，取检液（血）1ml，加入正己烷2ml、1mol/L磷酸二氢钠溶液2ml、0.25%氯胺T水溶液1ml，在冰浴中反应10min，充分振摇，使生成的氯化氰转入己烷中，抽取己烷1μl进行GC/ECD分析。

色谱条件——RT-Q-Plot 胶粘色谱柱30m×0.53mm×1.2μm，柱温为 110℃，进口温为260℃，检测器（ECD）温为320℃，载气（N2）3ml/min。

②    利用预柱衍生化顶空气相色谱分析法：血中氰化物在酸性条件下释放气体与

含氯胺T的预柱反应。方法灵敏度为0.05μg/ml。