主题：【资料】离子色谱基本原理(共19讲)

第四章 离子色谱检测的类型 （4）

抑制容量是单位时间中和的淋洗液摩尔数。纤维抑制器的动态容量受到淋洗液离子从淋洗液流动相到膜的扩散的限制。微膜抑制器克服了这个缺点，因为微膜抑制器的淋洗液和再生液室中各有一个高容量离子交换网屏。淋洗液从淋洗液室的一端进入，沿网屏的长度方向通过网屏，从另一端出去。再生液的流路与此相似，但方向相反。拧紧外面的紧固螺丝使网屏和膜之间紧密接触，以免发生层流现象。
网屏以两种方式将流路中的Na+离子移至膜上。其一，网屏的三度空间结构可有效地将淋洗液流分散并引导其与邻近的膜接触。其二，网屏上的离子交换位置对Na+离子提供了一个向膜移动的连续通道。网屏的机械结构和离子交换功能结合起来，就大大地减少了动态容量对淋洗液离子到膜的扩散的依赖关系。
第二个再生液室明显增加抑制器容量。这是由于它使膜的表面面积增加了一倍，而且在淋洗液室的两边都存在H+离子源，减少了扩散，增加了单位时间能中和的淋洗液离子的量。
微膜抑制器的突出优点是死体积非常小(小于50μL)和抑制容量高。因此可用较强的淋洗液，在进行高灵敏度分析时能得到稳定的基线。
阳离子与阴离子微膜抑制器的结构相同，其不同之处只是前者用阴离子交换网屏和总体功能基的阴离子交换膜；而后者是采用阳离子交换网屏和总体功能基的阳离子交换膜。
由于微膜抑制器是抑制容量高达40000μS电导的淋洗液，可适用于进行梯度淋洗。
4.电化学抑制器
电化学方法对离子色谱中的电导进行抑制，是厦门大学田昭武等人最早提出并商品化的。它采用电解水产生H+和OH-，使电解产生的H+和OH-透过阳离子或阴离子交换膜，使淋洗液的Na+或Cl-与之发生交换，进行电导抑制，其结构类似于平板膜抑制器。由于国内的膜技术相对落后等各方面原因，厦大生产的电化学抑制器在使用前要通入一些硫酸或氢氧化物，再进行抑制，但它不必采用连续再生。因此，它实际上是电化学和化学抑制法的组合。
美国Dionex公司将这一电化学抑制法进行改进，在它的平板微膜抑制器生产的基础上，设计了电化学自再生抑制器，其结构示意如图4.8所示。



图4.8 电化学自再生抑制器示意图及连接方式
其工作原理与平板微膜抑制器相同，所不同的是它的H+源或OH-不是通过连续再生液得到的，而是通过水的电解产生，其水源可以外接蒸馏水，也可以是检测器流出的淋洗液，图4.8(a)为采用环循方式进行自再生，(b)为采用外接水源方式进行自再生，一般外接水源方式在淋洗液含有有机溶剂时采用。
三、离子排斥色谱中的抑制
对阴离子的离子排斥淋洗液的抑制，最早是利用盐酸(淋洗液)和银型树脂之间的沉淀反应.此反应中，Ag+与Cl－生成AgCl沉淀。为了保持树脂的电荷平衡，淋洗液中的H+进入树脂的交换位置，这样就从淋洗液中完全除去了HCl。样品离子An-在抑制柱中通过下述反应转变成银型抑制柱之后,加一个H+型的后置抑制柱，将样品阴离子从银型转变成酸型。
因为只有样品阴离子进入后置抑制柱，所以此柱的消耗(即树脂从H+型转变成Ag+型)速度很慢，一般使用一个月之后需要再生。由于这种抑制反应是一种沉淀反应，理论上可用浓NH4OH再生，但需要很长时间，无实用意义。此外随着AgCl沉淀的增加，抑制柱的压力逐渐上升，可观察到明显的扩大的AgCl沉淀带，必须用峰面积计算才能得到准确的结果。
后来发展了一种适合于阴离子排斥的纤维抑制柱，其纤维是一种磺酸型离子交换膜，结构与一般纤维抑制柱相同，淋洗液在纤维管内流动，再生液在纤维管外与淋洗液相反的方向流动。用烷基磺酸盐作淋洗，用氢氧化四丁基铵(TBA)为再生液，再生液中的TBA+与淋洗液中的H+交换，再生液中的OH-与淋洗液中的H+结合生成水，从而降低了H+的高背景电导。RSO-3／TBA+离子对的电导比RSO－3／H+低很多，可得到很低的背景电导。
这种抑制方式还可以在平板微膜型离子排斥抑制器中实现，但目前还没有电化学自再生型的离子排斥抑制器。
四、流动相离子对色谱的抑制
流动相离子对色谱与普通离子对色谱的主要区别在于它用化学抑制型电导检测器。抑制器的作用是从淋洗液中除去离子对试剂，同时将待测离子转变为对应的酸型或碱型。例如，在阴离子流动相离子对色谱中，在H+型抑制柱发生两个重要反应：
(1)离子对试剂(R4N+OH-)中的阳离子(R4N+)被除去，OH-离子对被树脂的H+离子中和成水.
(2)转变样品离子A-成对应的酸.
五、抑制电导检测的种类
电导检测是检测进入检测池的离子，包括有机和无机离子，最适用于强酸／碱的阴／阳离子。例如SO2-4、Cl-、Na+、K+、三氯乙酸等。当检测弱酸／碱的离子时，检测的灵敏度主要取决于它们的pK值。
1.阴离子
pKa＜3时，检测灵敏度最高，pKa在3～7之间灵敏度比较低、信噪比下降，pKa＞7时的阴离子，在某种条件下可以被检出，这是由于随着pKa的增大，电离度减少，使背景电导值与被测离子电导值相似。因此，有机酸、羟基化合物、磺化物、磷化物等官能团的pKa＜4.75，可以采用电导检测，而检测普通的无机强酸阴离子，如Cl-、NO3-、SO2-4、PO3-4，电导检测是最理想的。
2.阳离子
无机阳离子的检测包括碱金属和碱土金属，而过渡金属离子由于水解或在抑制器中产生沉淀，不易检出。过渡金属离子通常在加入螯合剂发生柱后反应时，进行可见波长的检测。几乎全部有机阳离子都是胺类，脂肪胺的pKa＜7易被检出，但芳香胺和杂环胺的pKa值在2～7之间一般保留很强，采用阳离子交换时加入有机改进剂，从而使电导检测的噪声增大，因此不适宜于抑制型电导检测。虽然非抑制型电导检测可以分离检测，但灵敏度很低，通常应使用紫外或直流／积分脉冲安培检测。
3.两性离子
两性离子不宜通过抑制电导检测，它们一般包含阴／阳离子的官能团(例如：氨基酸带有氨基和羧基)。在通过抑制器时，将改变形态以致于不能到达检测器；非抑制型电导检测时，特定pH值的流动相可以使分子保持电荷而被检出。大部分包含胺基的两性分子，最好使用脉冲／积分安培检测；而紫外检测可以用于芳香胺族的两性分子的检测。
六、电导检测的流动相
选择流动相时，必须考虑到分离和检测方法。为了保证最佳的分离效果，流动相的淋洗强度、分离效率是主要依据。对于电导检测而言，一个好的流动相与目标离子的电导响应值和背景的大小相联系。
流动相一律是由水和强电解质组成。如果使用有机溶剂兼容的柱子(如OmniPac或MPIC)，就可以使用典型的反相溶剂(甲醇或乙腈)，有机溶剂是离子对流动相的重要成分，并可在离子交换分离中控制灵敏度。由于有机溶剂不导电，也就不会干扰电导检测。

第四章 离子色谱检测的类型 （5）

1.阴离子交换分离
使用抑制器时，流动相的离子化成分在抑制器中转化为弱电导成分，使用弱酸的钠盐，是因为它们在抑制器中被转化成为近中性的酸。酸的pKa值越高，其背景电导就越低，使用pKa＞5的弱酸可以进行等浓度的淋洗，然而进行梯度淋洗时pKa应大于8，这样可使基线漂移减至最小。
NaOH溶液是用于阴离子交换的一种很好的淋洗液，因为OH-在抑制器中被中和成水，它更多地用在梯度淋洗中。另一种常见的流动相是Na2CO3／NaHCO3缓冲溶液，它被抑制为碳酸(pKa=6.2)，其背景电导值约为10～20μS，可适用于等浓度淋洗，但不适用于梯度淋洗。
其他用于抑制型阴离子交换色谱的流动相还有硼酸的钠盐(pKa=9.2)和对氰酚(pKa=8.0)。硼酸盐是弱电离的水合无机酸，由于它的pKa值大，抑制后的背景电导很低，对梯度淋洗很有用。对氰酚具有疏水性的一元取代基，用于淋洗强保留的疏水性一价阴离子如I-、SCN-等。在非抑制型阴离子中，流动相中离子成分的电导与目标离子的电导不同。应使用苯甲酸盐和邻苯二甲酸盐这些大分子、低摩尔电导的物质作淋洗液。葡萄糖酸盐／硼酸盐溶液也具有低的背景电导值。在进行高浓度分析时，灵敏度和基线噪音应在可以接受的程度之内。
2.阳离子交换分离
稀强酸经常与有机溶剂混合。作为分离碱金属和碱土金属的淋洗液，配备自再生阳离子抑制器可以使用甲磺酸。使用甲磺酸／乙腈进行梯度淋洗，一次进样可以分离多种胺类和无机阳离子。
某些分离柱需要一种比H+更强的取代离子，淋洗保留性比碱土金属还强的离子，这就需要将2，3二氨基丙酸(DAP)与强酸混合后使其质子化。
对阳离子非抑制型离子色谱而言，最好的流动相是稀释的强酸(1mmol／L HNO3),但其背景电导值很高(1mS)，以至于信噪比不足以检测低浓度离子，既然H+的电导高于其他阳离子，因此洗脱被测离子时电导值降低，所以分离过程出现负峰。
3.离子对
用于离子对色谱的流动相通常由水、有机溶剂和疏水性离子对试剂组成。分离阴离子使用四元胺的钠盐，分离阳离子使用长链的磺酸盐。对于抑制型电导检测，这些试剂可以提供离子对：OH-(阴离子对)和H+(阳离子对)。
4.3吸光光度检测
离子色谱用的吸光光度检测器主要有紫外和可见光光度检测器，它们也是高效液相色谱中用得最早而又广泛使用的检测器。目前，离子色谱采用吸光光度检测，其原理几乎与现有的高效液相色谱所配置的吸光光度的检测器完全相同。它不仅有高的选择性和灵敏度，而且对环境温度、流速波动、淋洗液组成的变化不敏感。因此无论等浓度淋洗还是梯度淋洗，都可采用。对强吸收物质的检测下限可达1ng。
一、吸光光度检测原理
吸光光度检测器是通过测定物质在流动池中吸收紫外光的大小来确定其含量的。对于单色光，物质在流动池中的吸收服从Beer定律.对于给定的池体积，在固定的波长下，待测物的吸光度与其浓度成正比。
二、吸光光度检测器结构
吸光光度检测器可分为单波长、多波长及连续波长检测器，由于技术的不断改进，目前均采用连续波长检测器，其结构如图4.9所示。


图4.9吸光光度检测器光路图
(1)光源：在紫外区工作(190～400nm)时，采用氘灯；在可见区工作(350～800nm)时，采用钨灯。
(2)单色器：设定光栅的不同角度实现波长的选择。半透半反镜把光线分成两束，一束进入检测器，另一束作为参比信号。
(3)检测池：由测量池和参比池组成，为了减少色谱峰的扩展，测量池通常小于10μL，池内径约1mm，光路长度约10mm。
(4)接收元件：可以是光电倍增管、光电管或光敏电阻，其相应的电子线路也有多种形式。采用光敏电阻作接收元素，测量线路是普通的惠斯登电桥；采用光电管或光电倍增管时，测量线路是微电流放大器。
三、吸光光度检测器的应用
吸光光度检测器可以测定大量的有机物，许多无机离子有紫外吸收也可以直接进行测定。除了直接测定，吸光光度检测器还可以用于柱后衍生、间接检测法对大量无光度吸收物质分析。
一般都选择对欲分析物有最大吸收波长进行检测，以获得最大的灵敏度和抗干扰能力。测定波长的选择取决于待测物的成分和分子结构，分子中光吸收性强的基团叫发色基团，它与分子的外层电子或价电子有关。不论是普通高效液相色谱，还是离子色谱，流动相的组成影响它的紫外检测的最小波长界限一般来说，离子色谱的淋洗液是盐类化合物如Na2CO3、NaOH或HCl混合物的水溶液。它们可能含有乙腈或甲醇、乙烷磺酸和氢氧化四丁基铵等有机物。
四、柱后反应衍生法
多数无机离子和氨基酸一类有机离子没有紫外吸收，不能直接用光度检测器检测。若在分离柱后连续地加入显色剂，使这些离子生成带有发色基团的衍生物，即可用光度法来检测，这种方法称为柱后反应衍生检测法。此法已广泛用于分析重金属离子、氨基酸、多元胺、多聚磷酸盐和EDTA等，是一种十分有效的检测手段。图4.10所示为一种柱后衍生检测的分析流程图。


图4.10柱后衍生检测示意

第四章 离子色谱检测的类型 （6）

柱后反应器装在分离柱出口和检测器之间，分离柱流出液与显色剂在一个特制的三通内混合，三通应具有小的死体积并能确保两种溶液充分混合。显色剂可以用一专用泵输送，也可以将它盛在加压气罐内用氮气压出。混合液再流经由螺旋管组成的反应器进行反应，生成的带发色基团的衍生物进入光度检测器内检测。螺旋管的长度由衍生物生成时间来决定。为了减少色谱峰的柱后扩散，螺旋管的内径应在0.5mm以下，或采用内径1mm，填充有0.6mm惰性微球的塑料管。必要时可将反应管加热以促进反应的进行。
Dionex公司将一根可渗透试剂的特殊空心纤维管绕在柱后衍生器的轴上，其结构与纤维抑制器相似。由分离柱流出的洗脱液在纤维管内从上往下流动，柱后反应试剂在管外。管壁允许试剂渗透进去，由于管外充满了在一定压力下的可渗透入管内的试剂溶液，使在管内流动的洗脱液不能渗漏到管外，而试剂不断地被加到纤维管内的洗脱液中，这种加入试剂的方法比混合池均匀，而且由于纤维管细而长，新的试剂连续地加入，试剂与样品离子之间的接触比直接混合更有效，不仅增加了反应速度而且使反应更完全。
柱后反应检测技术的应用，增加了检测器的选择性和灵敏度。应用此法对显色剂的选择十分重要，选择时应遵循以下原则：
1.发色反应最好在2min内完成，以获得良好的重现性。
2.显色剂的使用应充分过量并用高浓度的缓冲溶液配制，以维持恒定的pH值，保证反应进行得快速完全。
3.显色剂的加入体积应为淋洗液的10%～15%，以减少其稀释作用。
4.在检测条件下，试剂本底吸光度应保持在最低限度。
5.试剂能在长时间内保持很好的稳定性。
另外，柱后反应衍生法还可以用于氨基酸和一些生物活性胺分析中，用柱后反应衍生检测法将试样分子中的伯胺基团与邻苯二醛反应生成荧光活性衍生物，然后用荧光光度检测器检测。
由于大多数无机金属离子在紫外光谱区吸收弱，特别是过渡金属离子由于两性离子或沉淀无法用抑制电导检测，而电化学检测选择性较高，只适用于个别的金属离子。因此柱后衍生紫外吸收检测法应运而生，该法特别适合于高价金属离子过渡金属离子和镧系金属离子等的检测。
最常用的金属离子衍生试剂是4-(2吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)。将1mmol的PAR溶解在pH值较高的缓冲溶液(如NH3NH4Ac)，PAR可以与大多数过渡金属离子(包括镧系)形成络合物，在520nm处检测。
此外，还有其他一些金属离子如4，5-二羟基间苯二磺酸衍生测定铝离子，1，5-二苯基
碳酰肼衍生测定铬(Ⅵ)离子，钼酸盐衍生测定硅酸盐和磷酸盐等。
对于氨基酸分析，柱后衍生试剂可以采用茚三酮，在130℃的温度条件下检测，在570nm下
有最大吸收并加以测定，同样茚三酮也可以用于检测蛋白质和多肽等化合物。
五、间接检测法
间接检测法就是在流动相中加入适量的有检测响应的物质以检测无响应的被测定化合物的分析方法，这种方法在技术和操作上比较简便。间接检测方法的基本原理很简单，在液相色谱流动相中加入一个具有可检测响应信号的与固定相有一定亲合力的物质，通常称之为探针试剂；注入的被分离样品由于对可检测的探针试剂的二相分配过程的影响，导致检测器对被分离物质的间接信号响应。
间接检测法主要用于光度检测器，如紫外吸收检测器和少数荧光检测器，以测定无紫外吸收的样品，它同样也用于单柱型阳离子电导检测。在一些抑制电导检测和安培检测中，采用这种方法可以大大扩展离子色谱的应用范围。
以紫外吸收检测为例，我们对其检测原理进行讨论。紫外吸收检测器能直接检测具有紫外吸收的有机离子。部分无机和有机离子在低波长紫外区有吸收，也能直接检测。而大部分无机离子和一些有机离子紫外吸收低，要采用紫外吸收检测时，只能采用化学衍生或间接光度法测定。
一般在离子对色谱光度检测中，被测离子带有发色基团，在流动相中加入无色基团的反离子形成离子对被检测。而在间接光度离子对色谱法中，流动相中加入的是带发色基团的反离子，形成了高的紫外吸收本底。当注入无紫外吸收的被测离子时，被测离子与反离子以静电力结合在一起形成离子对，在键合相与含水流动相之间进行分配而被分离。由被测离子引起反离子基流的变化，而产生了检测信号的变化。这种紫外吸收试剂又称为离子对探针，而这种形式的离子对可以认为是一种特殊的衍生化形式。
为了实现间接光度法检测，洗脱液要满足一些化学上或光度测量上的要求，通常使用低浓度的洗脱液有利于灵敏度的提高。要获得精确的测量，吸光度值应在0.2～0.8范围内。当固定相和流动相都确定后，最佳吸光度范围可借助于调整检测器的工作波长来实现。间接光度检测的灵敏度通常高于一般的电导检测器，其最低检出浓度低于10-6g／mL。
在间接光度检测中，有两类色谱峰：一类是流动相本身组分产生的系统峰，另一类则为样品峰。这两类峰的出峰方向比较复杂，尤其是在离子对色谱系统中，对此必须特别注意。
间接光度检测法除了可以用于常规的阴离子检测外，还可以用于含芳香基的胺类及季铵盐、芳香基磺酸盐、金属络离子的检测。
4.4电化学检测
电化学检测器(electrochemical detector,ECD)是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的。从广义上讲，电化学检测器包括安培、极谱、库仑、电导、电压、电容等类型，其中安培、极谱、库仑检测器以测量电解电流的大小为基础，统称为伏安检测器，其中安培检测器在离子色谱中的应用最为广泛，因此一般在离子色谱中所讲的电化学检测器是指安培检测器。
一、安培检测器的工作原理
安培检测器，是由恒电位器和三电极电化学池组成。这3个电极是工作电极、参比电极和对电极。在工作电极与参比电极(Ag／AgCl)之间加一个产生氧化或还
原反应的工作电位，也称施加电位(Eapp)。电极的材料通常为玻碳、金、银或铂，用以确保施加电位的恒定，并阻止电流通过参比电极以避免参比电极的漂移。
在电化学池中所产生的电流是溶液中的分子在工作电极表面被氧化或还原而产生的。氧化反应时，电子从电活性组分的分子转移到工作电极上，产生正的电流或称为阳极电流。还原反应时电子从工作电极转移到电活性分子上，产生负的电流或称阴极电流。在电化学池中
Eapp的大小和极性决定是否能发生电化学反应，适宜的施加电位应使被测组分发生氧化或还原反应，而淋洗液及样品中其他组分不发生氧化或还原反应。
1.基本工作原理
假设由工作电极和参比电极组成的电解池中有被测组分A，在工作电极和参比电极逐渐改变外加电压，组分A在阳极表面上发生反应.
2.扩散电流
在一定的实验条件下，E1／2值与待测分子的浓度无关，仅决定于待测分子的本性。对带有电化学检测器的高效液相色谱，除了用保留时间定性鉴别被分离的组分外，还可以利用被测组分的电化学伏安特性进一步确定。具体的做法是可以比较被测物质和标准样品的伏安特性曲线的形状、半波电位或不同电极电位下的电流响应比值等。
伏安法是选择施加电位Eapp常用的方法，在一电化学池内，在很大范围内改变施加电位，同时测量由电化学反应产生的电流，作出施加电位对电流的关系曲线，即得伏安图，可以用来确定安培检测法的最佳施加电位值。
两种主要的安培检测形式(直流／积分检测)测量分析离子在工作电极表面发生氧化还原反应所产生的电流或电荷。在氧化反应中，电荷从样品离子移向安培池中的工作电极，在还原反应中，电荷从工作电极移向分析离子。对于可以被氧化或还原的目标离子，可能存在的干扰物质不会被氧化／还原，因此检测非常灵敏且选择性高。当一个持续不变的电位施加于工作电极时，检测模式为直流安培，电位多次变化且重复时的检测模式为积分／脉冲安培。
二、电化学检测器结构
1.电化学检测器结构
安培检测器的性能，取决于多方面的因素。设计性能良好的检测器，需要考虑电极反应的程度。电极反应的程度，决定于试样的浓度、外加电压、两电极材料和色谱洗脱液的物理化学特性。检测器具体设计主要考虑以下几个方面：电极材料，检测池流体动力学条件和测量技术。
常用的伏安检测器由1个恒电位器和3个电极组成的电化学池构成。恒电位器可在工作电极和参比电极之间提供一个可任意选择的电位，使输出电位保持恒定。它不受电流变化的影响，减少了参比电位漂移，提高了检测器的稳定性。
安培检测器检测池如图4.12所示，常用的有薄层式和管式池。


图4.12 安培检测器结构A.薄层式 B.管式


第四章 离子色谱检测的类型 （7）

(1)薄层式检测池。
薄层式检测池是最常用的安培检测器，常简称为薄层池。它的检测范围为10-9～10-12mol／L，检测下限低，线性响应范围广，重现性良好。
检测池由两块特种塑料板之间压着一层中心挖空的聚四氟乙烯薄膜垫片组成。薄层池的容积由夹在中间的薄膜垫片的形状和厚度决定(膜厚度一般为50～150μm,容积一般为5～10μL)，薄层通道的容积过小会影响灵敏度，容积太大会使已经分离的色谱组分混合，影响分离效果。在电极良好抛光的条件下，通过减少液层厚度和增大流速来提高灵敏度，以测量极小体积的样品。
(2)管式检测器。
管式工作电极易于制造，工作电极与参比电极由离子交换膜隔开，检测池的灵敏度由管式电
极和池体积决定，受检测池的构型影响较小，其检测池的测量下限可达10-8mol／L，但其微型化及清洗等受到限制。
2.工作电极
一般离子色谱用的电化学检测可以采用四种不同材料的工作电极：金、银、铂、玻碳
选择工作电极的依据有以下4点：
(1)电位极限。
负电位的极限是流动相或电解质还原时的电位，正电位的极限是流动相、电解质或电极自身被氧化的电位。由于这些反应所产生的电流远远大于分析离子氧化／还原反应所产生的电流，所以用于检测分析离子的电位必须小于上述极限。电位极限受流动相的pH值影响很大，负电位极限在碱中更正；相反，正电位极限在酸中更正，在碱中更负。换句话说，可使用电位在酸溶液中变正，在碱溶液中变负。
当所施加电压接近极限电位时，噪声也就是背景电流增加。此时对于金属电极，背景电流急剧增加；对于玻碳电极，背景电流缓慢增加。因为可使用的最大施加电位要通过检测所需信噪比而得到.
使用玻碳和铂电极可以得到正电位极限的最大值，适于进行氧化反应。使用玻碳、金、银、电极可以得到负电位极限最大值，因为在铂电极表面，H+将被还原为H2，所以铂电极具有很低负电位极限，且一般不用于还原反应。
使用Ag／AgCl参比电极时，负电位可以接近-0.1V，流动相中分子氧化物的分解，将造成高背景电流，稀释流动相可以大幅度降低背景电流。


(2)电极对氧化／还原反应的影响。
氧化反应机理是研究被测离子在电极上发生氧化的过程。电极作为惰性的电荷吸收点，本身不参与氧化反应，这种反应原理决定了石墨是最佳的电极材料，例如儿茶酚胺和芳香胺的检测。
金电极和铂
电极在与被测物形成络合物或沉淀时，电极易被氧化，因此在检测这些被测离子时，工作电极的材料将发生反应而损耗，如铂电极在氰化物测定过程中，其电位比氰化物在其他电极上直接氧化成氰酸要低得多。使用较低的施加电位可
以增加分析的选择性，被氧化的成分也越少，而且低电位下流动相中痕量杂质氧化产生电流的噪声也将下降。
银电极也用于检测与其易络合或易沉淀的离子的测定，例如它在Br-、I-、HS-、SO2-3、S2O2-3、硫醇等物质的测定上。
(3)电荷转移反应的动力学。
由于电位在E0时，电荷转移反应进行很快，Nernst方程中描述了分析离子中氧化与还原的比例，这是可逆的。如果Eapp-E0=0.118V，那么电极表面分析离子中氧化物与还原物的比例是100∶1，几乎到达电极表面的分析离子全被氧化，但只能得到有限的电流，增强施加电位也无济于事；反之，还原反应是不可逆的，且在E0时电荷转移反应的速率很慢，这就需要施加一个高于E0的电位以加快反应的速率，这个电位叫做“过电位”。越不可逆的反应，过电位越大，这会造成噪声增加和选择性下降。许多物质的氧化／还原反应在特殊电极上比其他电极更易于发生。对于无机小分子，在铂电极上比玻碳电极更易于氧化／还原反应。例如：铂电极用于检测亚砷酸盐、I-、HS-。
(4)电极的长期稳定性。
选择电极材料时，一个主要考虑的问题就是如何维持其表面活性。在正向施加电位下，电极
表面会产生氧化层，它将阻止分析离子的氧化，造成重复进样时响应值降低。抛光电极可以恢复电极活性。玻碳电极比金属电极在阻止生成氧化层方面更具有优势且不需要经常抛光，这就是在直流安培中，它的应用比金属电极广泛的原因。积分／脉冲安培使用金／铂电极时，要施加很高的正／负电位以清洗电极。
3.参比电极和对电极
通常用Ag／AgCl或饱和甘汞电极作为参比电极，金、铂或玻璃碳电极作为对电极。参比电极、对电极应放在工作电极的下游，这样对电极的反应产物和参比电极的渗漏等不会干扰工作电极。对电极又称辅助电极、补偿电极，一般置于池的出口处，并尽可能地靠近工作电极，构成电化学反应中的回路。连接色谱柱到检测池的不锈钢毛细管有时可用作对电极，甚至以惰性材料建造的池体自身也可以充当对电极以抵偿电阻确保施加电压的恒定，并阻止产生大电流通过参比电极，减少电位漂移和提高检测的重现性。参比电极作为反馈溶液和电位信息的探针，随时与设定的施加电压进行比较，使电压跟随器和受控放大器互成恒电位器。工作电极保持在有效接地状态，因此在测量过程中，即使施加电位改变，其对地电位也相对稳定。三、电化学检测器的类型
离子色谱采用安培检测器主要分为两种类型：直接安培检测器和脉冲安培检测器。直接安培检测，采用恒定施加电压对被测物质进行测定。这类检测可以测定卤素、类卤素、S2-、酚类、醌类、胺类等化合物。
脉冲安培检测器一般用于糖类、氨基酸、醇类等物质的分析，这些物质在贵金属电极上被施加恒定电压下会产生沉积，使测定的重复性不好、灵敏度降低。因此测定时，在这类检测器施加一个电压，随后在这个电压后施加一个比较高或比较低的电压，对电极检测之后进行清洗，使安培检测器可以灵敏、重现地进行检测。
1.伏安法
安培检测所需的最佳电位源于一个电化学技术名词——伏安法。此项技术通过使含有目标离子和电解质的溶液流经工作电极而实现，它可以在一个具有旋转圆盘形的工作电极的烧杯形流动池中建立起来。也就是目标离子和流动相流经ED40的安培池时，借助预先设置的施加电压，可以测绘氧化还原反应所产生的电流。溶液未流动，并且设扫描电位先正后反，起始电位等于终止电位，此项技术称为“循环伏安法”。在此模式下，使用X-Y记录仪、示波器、计算机可以记录伏安图。

第四章 离子色谱检测的类型 （8）

2.直流安培
(1)选择施加电位。
对于直流安培而言，最佳检测电位对应于扩散限制电流。在前面的例子中，最佳电位是+0.6V，继续施加电位只能增加噪声，还将降低选择性。通过施加一系列电位得到不同的峰高，可以很容易的确定最佳电位——使用直流安培多次进样，并在每次进样后增加电位，所得到的结果见图idi-language:AR-SA">4.13，由此得出最佳施加电位为0.7V。


图4.13峰面积-电位关系图 
被测物氧化

第四章 离子色谱检测的类型 （9）


图4.19是积分脉冲安培检测的波形示例。当电位正向扫描时为金属氧化物生成的波形，在反向扫描为氧化物还原的波形时，电流被积分。没有分析离子出现时，电荷近似为零。积分过后，正／负清洗脉冲时间波形加入电位，使用类似脉冲安培的方法可以优化波形。


图4.19 积分脉冲安培波形示
通过取消从氧化到还原的电荷可以改善积分安培，对基线的影响也最小。图4.20显示了取消工作电极氧化电流的影响(10μg／mL亮氨酸(峰1)和乳糖(峰2)，15～150 mmol／L NaOH梯度淋洗)。


图4.20积分脉冲安培和脉冲安培的比较 
当前一步骤跨越金属氧化物生成波形时，电流被积分。此时基线漂移非常明显。另外，由于淋洗液在电极表面的抑制作用远远大于检测器的响应值，因而形成的负峰替代了样品峰，对正／反步骤积分的电流，最大程度地降低了基线的漂移，消除了负峰，从而明显改善样品峰的形状。

第四章 离子色谱检测的类型 （10）

1.光源2.10%反射棱镜3.激发光滤光片4.透镜5.测量池6.参比池7.发射光滤光片8.光电倍增管9.放大器10.记录器11.光电管12.对数放大器13.线性放大器
1.光源
由于荧光强度与激发光强度成正比，因此理想的激发光源应具备：
(1)足够的强度。
(2)在紫外-可见光区有连续光谱。
(3)光源强度与波长无关，也就是说光源的输出应有连续平滑、等强度的辐射。
(4)光强稳定。
现在较多使用的是能发出220～650nm连续光谱的氙弧灯。该发射光强度大，而且在300～400nm波长内，灯光谱强度几乎相等。
2.激发光和发射光单色器
荧光检测器的光学系统由光学透镜和单色器组成。光学透镜可分聚光透镜和荧光收集透镜。聚光透镜的作用是将激发光束准确地聚焦在检测池窗口上，荧光收集透镜是采集一定角度的发射光于光电检测器上。
激发光和发射光单色器的主要作用都是提供单色光。激发光单色器位于光源和流通池之间，能为样品激发提供单色光，又称为第一单色器；发射光单色器置于流通池和检测器之间，作用是提供适合检测的单色荧光，又称第二单色器。单色器的不同是荧光检测器分为多波长荧光检测器和荧光分光检测器两大类的主要依据。多波长荧光检测器用若干个滤光片作单色器，因此又称为固定波长荧光检测器。荧光分光检测器采用光栅作单色器，选择激发光波长和发射光波长。与固定波长检测器相比，荧光分光检测器能进行光谱的自动扫描。
单色器在荧光分析的灵敏度和选择性方面存在着相互制约的作用。窄光谱带的选择性好，但窄谱带仅占发射光谱的一小部分，灵敏度低。单色器的光谱带是由其色散能力和狭缝宽度决定的。单色器一般都有进出光两个缝，出射光的强度与单色器狭缝宽度的平方大约成正比，增大狭缝宽度有利于提高信号强度，缩小狭缝宽度有利于提高光谱分辨率，但要以信号强度的牺牲为代价。
多波长荧光检测器用短通路剪切式滤光片或宽带的光通带滤光片插在光源与流通池之间，作为激发滤光片(第一滤光片)限制最大激发波长。长通路剪切式滤光片作为发射光滤光片(第二滤光片)，插在流通池和检测器之间。通过发射光滤光片的波长上限应小于通过激发光滤光片的波长下限。滤光片单色器价格低，操作简单，但选择性不强，〖JP2〗而且还要经常根据波长选择的需要更换滤光片。
现在一般都采用光栅作为荧光检测器的单色器。光栅单色器与滤光片的单色器相比，优点是：(1)具有光谱扫描功能。
(2)分辨率高。
缺点是：
(1)仪器结构不够紧密。(2)灵敏度低。(3)成本高。
3.流通池
流通池的宽度b(光程长)是影响吸收型检测器灵敏度的重要因素。理论上b越大越好，但实际上b受到流通池体积引起的峰展宽的限制。荧光检测器的流通池的设计原则上是在尽量减小峰扩散的条件下，产生最大的荧光信号。从定量公式可以看出，荧光强度的影响因素多，b对灵敏度的影响不如吸收型检测器大，而流通池体积小，则有利于降低峰强度。常见的流通池体积为5～15μL。图4.22是吸收型检测器和荧光型检测器的流通池光路图。

第四章 离子色谱检测的类型 （11）

图4.22 荧光检测器流通池
两者的相同之处是入射光光辐和流动相流动方向一致。不同的是，荧光检测器还需要第二光轴：发射光轴。按入射光轴与发射光轴之间呈现的角度，荧光检测光路可分为直角光路(90°)，直通光路(180°)，反射光路(0°)和轴向光路(其他角度)。最普通的测量发射辐射的做法是与激发辐射呈直角，并对准流通池的中心部位进行测量。直角光路因对从光源来的直射光的干扰不敏感，得到的信噪比较好。直通光路可用标准的紫外吸收池，但必须仔细选择滤光片，以防杂散光到达光电检测器。否则，将得到很高的荧光本底，信噪比较差。与直角光路比，直通光路虽然对光源来的直射光的干扰敏感，但荧光收集效率高。图4.23是第三种类型的检测器流通池。反射池与凹面透镜组合在一起。池背面反射光防止激发光通过池到达光电检测器。凹面镜集聚散射荧光，从流通池射出并聚集在光电检测元件上，增强了荧光收集效率，而且减少了内滤效应，检测限得到提高。


1.入射光2.池体3.光学镜4.池腔(5μL)5.室杆6.发射光束
圆形石英池和直角形石英池在荧光检测器中都有应用。直角形流通池仅能用于与激发辐射的光路成0°、90°和180°角度上对发射辐射所进行的测量。以其他角度测量，在检测器方向上的发射辐射都将有不可忽略的一部分被池壁反射。
4.光电检测器
荧光检测器一般采用光电倍增管作为检测元件。光电倍增管是一种很好的电流源，在一定条件下，其电流量与入射光强度成正比，不仅起着光电转换作用，而且还具有电流放大作用。光电倍增管具有灵敏度高--电子放大系数可达108～109，线性响应范围宽--光电流在10-8～10-9A范围内与光通量成正比，响应时间短(10-9s)，已成为分析仪器中最常用的检测元件。用光电倍增管做检测器时，可用模拟型和计数型两种方法检测。当信号较弱时，需取多次扫描的平均值来提高信噪比，采用光子计数型检测。光子计数型有较高的检测灵敏度和稳定度。对于相对较大的信号，模拟型检测的线性好，测量精度高。光电倍增管的灵敏度受暗电流限制，暗电流主要由阴极和二次发射极的热电子发射和电极间的漏电形成。不同型号的光电倍增管，由于所用的光阴极光敏材料不同，其光谱响应特性也不同，适用于不同的波段。由于单色器和光电倍增管的非理想化光谱响应，发射光谱会产生歪曲，要获得真实的发射光谱就必须进行校正。
三、荧光检测器在离子色谱的应用
荧光检测器的最大优点是有极高的灵敏度和良好的选择性，一般来说，它比紫外吸收检测器的灵敏度要高10～1000倍，可达μg／L级，而且它所需要的试样很少，因此在药物和生化分析中有着广泛的用途。
某些物质虽然本身不能产生荧光，但含有适当的功能团可与荧光试剂发生衍生反应，生成荧光衍生物，也可用荧光检测。衍生方法有两种，其一为柱前衍生，此法较简单，但定量重复性较差；其二为柱后衍生，此法重复性好，但会造成谱峰的扩展。在离子色谱中，可以采用柱后衍生的方式对氨基酸和肽进行分析。
早期的荧光检测器在离子色谱分析中的应用主要是采用离子色谱分离氨基酸，然后经柱后衍生，用荧光检测器检测。随着离子色谱技术的发展，目前离子色谱的氨基酸检测，已经可以采用通用的紫外检测器，或不经柱后衍生，直接利用脉冲安培检测，荧光检测器的离子色谱的应用也趋于减少。
随着离子色谱的广泛应用，特别是新的色谱柱发展，使离子色谱的应用范围从常规的阴离子发展到大量无机、有机可电解物质的测定，特别对环境中痕量的有机物的分析，采用紫外检测器往往难以达到较高灵敏度和较好检测限。为此，我们将离子色谱与荧光检测器联用，用于测定痕量的有机污染物，使灵敏度大大提高，检测限水平比紫外检测器降低2～3个数量级。一般强荧光物质往往具备如下特征：
（1）具有大的共轭π键结构。
（2）具有刚性的平面结构。
（3）具有最低的单线电子激发态。
（4）取代基团为给电子取代基。因此，荧光检测特别适用于含有-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN基团，又含有多环芳烃的化合物，而这类化合物只要溶于水，均可以采用离子色谱分离。
例如采用阳离子交换分离，荧光检测器可以测定2-和4-氨基萘，采用荧光检a析方法。
pH值对可离子化的某些荧光化合物的影响很大。例如未解离的苯酚和苯胺分子会产生荧光，但其离子却不产生荧光。苯酚在pH=1的溶液中荧光最强，而pH=13的溶液中无荧光；苯胺在pH7～12的溶液中能产生荧光，而在pH＜2和pH＞13的溶液中都不产生荧光。
在紫外光照射下能产生荧光的化合物，绝大多数为环状化合物，但环状结构并不是产生荧光的必要条件。某些链状化合物如硬脂酸盐、棕榈盐也同样可产生荧光。

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