主题：【第三届原创参赛】悬而未决的液相色谱谜题——氟罗沙星有关物质分析

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茅茅

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发表于：2010/09/14 13:09:41 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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序：

感谢论坛举办一年一度的年会活动，增加彼此了解；感谢论坛组织原创大赛，并且准备了丰厚的奖品。九月份的大奖真是吸引人啊！于是我在脑海里搜啊搜啊，想起了年代久远（2002年或2003年）的一个悬而未决的问题，是关于液相色谱分析有关物质的，哪个品种呢？只记得前两个字：氟罗，一搜，嘿！仪器论坛里的另一位同仁也求助了类似问题，且没有得到解决，原来大名是——氟罗沙星。http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20031119/219566/看来的确是药物分析的一大谜题啊！本着为后辈铺路垫脚的精神，当然，也本着一不留神中大奖的精神，本人决心对7、8年前通宵熬夜苦解这道难题的经过写一个小故事，希望后来者能够在不久的将来破解这道谜题，重新制订药品标准。

前言：

做过液相色谱分离的同志都知道，液相色谱的关键是流动相，流动相成分和比例摸好了，实验就成功了一半。多数化学药的检验根据药典标准确定的流动相，色谱柱能够完成快速分析。固定相一般是不变的C18。（跟气相相反，气相不变的是流动相载气，变化的是固定相色谱柱，根据极性强弱(由弱到强)分为HP-1, HP-5, DB-624，PEG2000等）

根据流动相组成的简单与否，分为以下几种：

1 甲醇（乙腈）- 水系统：最为简单，其突出优点是实验前不用配流动相，实验后不用冲洗柱子；分到这种检品简直是幸福得象中彩一样，怎么说？在药物分析中这种例子是并不多见的，占的比例为10%左右。

2 甲醇（乙腈）- 弱酸（1%冰醋酸或磷酸）弱碱（三乙胺）系统：配制较简单，在水相中略加一些酸或碱，调节pH，占30%左右。

3 甲醇（乙腈）- 缓冲溶液（磷酸二氢钾和磷酸氢二钾为代表）系统：配制稍复杂，需要加盐溶解后调节pH，然后抽滤，占药物分析的大部分，45%左右。

4 甲醇（乙腈）- 离子对试剂：水相为烷基硫酸钠或烷基磺酸钠，占10%左右。

5 其他：流动相中增加了其他有机溶剂，如四氢呋喃。占5%左右。

正文：HPLC法分析氟罗沙星有关物质

仪器：岛津10-AD 单泵

流动相：乙腈- 磷酸-三乙胺溶液

我感到分析条件摸索的难点就在于磷酸和三乙胺的浓度的把握和pH的确定。根据前言所述，这个流动相属于第2种情况，但是条件摸索的过程工作量是相当大的。当时是单泵，每改变一个条件需要中间更换流动相等待半小时以上，没有足够的耐心根本不行。这是一个相当磨人的活。

我们来看看可以变化的条件：一是乙腈与水相的比例，二是磷酸和三乙胺的浓度（这个好说，一般有确切的范围），三与二相关，就是pH值。好吧，为了简化一点，干脆可变的条件就两个：流动相比例和pH值。

如果换成现在的我去做这个实验，我将有意识地将比例分为10:90, 20:80, 30:70, 40:60，60:40， 70:30， 80:20， 90:10 八种，pH分为3.5, 4.0, 4.5, 5.0，6.0五种，为什么选择在弱酸性范围呢？因为三乙胺的加入是用于峰形的收尾，也就是加强对称性的，而选择磷酸的目的应该是为了让流动相保存弱酸性的。那么用排列组合来计算一共有几种可能性呢？40种！这还是最简单的算法。

但是在当时的情况下，我的大脑还没有这样思路清晰，属于瞎猫碰死耗子阶段，（平时看色谱理论书太枯燥，或者还没有融会贯通吧），事隔多年，当初到底如何摸索条件的思路已经记不清了，但是实验结果是印象深刻的，实验过程与代价更是记得清清楚楚。

实验过程：在寂静的黑夜，整个大楼就我一个人，一盏日光灯，一台仪器，一把躺椅，我进1针，过1个小时看实验结果，不满意，换流动相，平衡1小时，再进1针，过1个小时看实验结果，不满意，再换流动相，再平衡1小时，再进1针…，直到外面天空有些微亮，传来清洁车工作的声音。我摸索的条件最多5个，一个通宵过去，毫无进展。连续3天，天天如此。郁闷到了极点！最终放弃了！

实验结果：前面所说的不满意到底是一种什么样的情况呢？真是从来没有碰到过的，现象之一是杂质峰与主峰分不开，而且改变条件后这个杂质忽前忽后，就是与主峰挨着，且肉眼可辨（肉眼不可辨的话就忽略了）。现象之二是杂质峰比较多，实在记不住有几个了。

后记：

希望这个小故事能给大家以启发，将药物分析工作开展得更好，将药品标准制订得更完善。

奖品许愿：乐扣乐扣6件（从大到小6件，10件太多了），外加北京一卡通一张。