主题：【分享】LC-MS/MS 测定牛奶中六种青霉素类抗生素残留

1 前言
青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯唑西林、奈夫西林等均为宽带谱青
霉素类抗生素，广泛用于兽药治疗中。该类药物用于产肉动物的呼吸、肠胃、泌尿生殖和
皮肤病毒感染的治疗和预防，它的使用将引起肉用动物兽药残留的存在，这种残留将对青
霉素过敏的人产生健康危害，更为重要的是，抗生素被过量食入健康人肠道，会破坏健康
人肠道正常菌群环境，导致人体免疫力的降低[1]为确保消费者的食品安全，欧盟已规定动
物组织和牛奶中上述各种青霉素允许最大残留量分别为4～30μg/kg。美国FDA 规定牛奶
中青霉素类抗生素的安全限2.5～5μg/kg。

目前，对食品中青霉素类抗生素残留的分析方法仍然采用传统的微生物法和HPLC 法
[2]。常规HPLC 往往仅适宜于测定基质比较单一的样品，对于具有复杂基质的生物样品的
抗生素，特别是痕量残留的抗生素，往往由于高的背景干扰而难于定量分析[3]。 E.Verdon,
P.Couedor [4]曾报道用柱前衍生-离子对高效液相色谱法测定牛奶中的异恶唑青霉素残留，但
前处理步骤复杂，操作实验的重复性难以控制，其准确性和选择性较差； D.M.HoLstege[5]
等采用LC-MS 测定了牛奶中5 种β-内酰胺类抗生素残留。阿莫西林、氨苄西林、青霉素
G、青霉素V、氯唑西林用乙腈从牛奶中提取出来，然后用C18 反相液相色谱分离和质谱
检测。Sonja Riediker 和Yuko Ito 也用LC-MS/MS 来测定牛奶中的青霉素含量，准确性较
好，但灵敏度不高[6-7]。
本实验结合各方法的优点，样品采用乙腈沉淀法除蛋白，固相萃取浓缩富集，反相色
谱分离，电喷雾离子化，在串联四极杆质谱仪中，多离子反应监测（MRM）定量法进行检
测。最低检出浓度低于欧盟和FDA 对牛奶中的青霉素类抗生素残留的限量要求，说明本方
法可满足欧盟和FDA 对牛奶中的青霉素类抗生素残留的限量要求。具有简单、准确、高
效、稳定，选择性好、灵敏度高等优点。
2 实验与材料
2.1 实验材料
2.1.1 牛奶样品：超市购买
2.1.2 唑西林钠、奈夫西林钠、双氯唑西林钠、苯唑西林均购自美国Sigma 化学公司；青霉
素G 钾、青霉素V 钾购自中国药品生物制品鉴定所
2.1.3 内标：氘代青霉素G（PCG-d7）购自剑桥同位素实验室
2.1.4 甲醇，一级色谱纯，美国Merck 公司出品
2.1.5 乙腈，一级色谱纯，美国Merck 公司出品
2.1.6 甲酸，分析纯，TEDIA 化学公司
2.1.7 水为MiLLi-Q 系统纯化水
2.1.8 标准储备液的配制：分别称取氯唑西林钠、奈夫西林钠、双氯唑西林钠、苯唑西林、
青霉素G 钾、青霉素V 钾各1mg，用50%甲醇水溶液溶解并定容至25mL。各储备液浓度
均为100μg/mL。
2.1.9 青霉素G-D7 内标溶液的配置：准确称取0.0100 克内标，用甲醇定容至50mL 棕色瓶
中，混匀，浓度为200ng/mL，再用甲醇稀释至20 ng/mL。
2.2 实验设备
2.2.1Waters 高效液相色谱-质谱系统，（Waters 2695 Separations Module, Waters 2996
Photodiode Array Detector, Micromass Quattro UltimaTM Pt ,Waters 2414 Refractive Index
Detector, Empower TM 软件）。
2.2.2 色谱分离柱：Atlantis dC18 5μm 2.1×150 mm column
2.2.3 固相萃取装置：固相萃取柱：Waters HLB 柱，60mg/5cc
2.2.4 Milli-Q RiosTM 水纯化系统，美国Millipore 公司出品
2.2.5 WH-861 涡流混合器，太仓市科教器材厂生产
2.2.6 PH-S3 酸度计
2.2.7 BECKMAN AvantiTMJ-20XP 高速离心机
2.2.8 抽滤装置、电子天平、精密移液枪、超声波震荡器以及其它实验室常用仪器设备
2.3 实验条件
2.3.1 色谱分离条件：
色谱柱：Waters AtLantis ODS-C18 柱，2.1×150mm，粒径5μm;柱温：30℃；样品温

度：室温； 进样体积：10μL；流动相A：含0.1%甲酸的水溶液B：含0.1%甲酸乙腈；流
动相梯度洗脱条件见表1。
表1 高效液相色谱分离梯度条件
时间
(min)
水(含0.1%甲酸)(%)
乙腈(含0.1%甲酸)
(%)
梯度变化曲线
0.00 85 15 1
5.00 70 30 1
6.00 50 50 11
17.00 50 50 1
17.60 0 100 5
20.00 85 15 6
26.00 end
2.3.2 质谱条件
2.3.2.1 离子源(Source)：ESI(+); 毛细管电压(CapiLLary)：3.80kV；锥孔电压(Cone)：50V；
离子源温度（Source Temperature）：100℃；锥孔反吹气流量(Cone Gas FLow)：55 L/hr；
脱溶剂气温度（DesoLvation Temperature）：350℃；脱溶剂气流量（DesoLvation Gas
FLow）：402L/hr。
2.3.2.2 质量分析器：分析器1 低端分辨率RF Lens1:12.5V；高端分辨率HM Lens1:12.5V；
入口透镜电压（Entrance）:-2v；碰撞电压（CoLLision）：8-16V；碰撞梯度：2.0；出口电
压（Exit）：1.0V；分析器2 低端分辨率RF Lens2: 12.5V；高端分辨率HM Lens2:12.5V；
六种青霉素类抗生素色谱和质量条件参数详见表2。
表2 六种青霉素类抗生素质谱条件参数
名 称
Retention time
(min)
MH+ Daughter ion
CoLLision Energy
(eV)
青霉素G
12.98
335.15
160.00＊
176.05
8
8
青霉素V
13.84
351.17
160.00＊
114.06
8
28
苯唑西林
14.61
402.20
160.05＊
243.12
12
12
氯唑西林
15.70
436.15
60.06＊
77.10
16
16
奈夫西林
16.21
415.23
199.11＊
171.07
16
36
双氯唑西林
17.87
470.12
160.08＊
311.10
20
20
＊：表示定量离子
2.4 实验方法
2.4.1 提取
吸取5.00mL 牛奶样品于50mL 的离心管中，摇匀，加入5mL 乙腈涡流混合60 秒，再

加10mL 乙腈涡流，离心5 min（1800rpm,260g），取10mL 上层清液，用氮气（0℃）吹
干，加入3mL 磷酸盐缓冲液（PH4.5），涡流15 秒。
2.4.2 活化：
HLB 柱依次用3mL 甲醇，3mL 水活化。
2.4.3 净化：
将样品溶液以1-2 毫升/分钟的速度完全过柱后，抽干HLB 柱中的溶液，再用
8mL70%乙腈水溶液洗脱，用定量瓶接取洗脱液。将净化后的样品溶液定容至10mL，经
0.3μm 微孔滤膜过滤后用于LC-MS/MS 测定。
3 结果与讨论
3.1 方法的优化
3.1.1 固相萃取柱的选择
由于在牛奶中存在多种基质，会产生干扰电喷雾过程的离子化程度效应，因此，在进
样前需要进行醇化处理，否则从而影响测定结果的灵敏度和准确性。加之牛奶中的蛋白质
也必须在进样前去除，否则会影响色谱柱的使用寿命。本文分别采用HLB 固相萃取柱、
C18 柱、MAX 柱等对样品进行净化，实验结果表明：后两种柱子的保留能力及洗脱效果较
差，而采用HLB 固相萃取柱进行净化，平均回收率均在90%以上。可见，HLB 固相萃取
柱可作为理想的固相萃取柱用于牛奶样品的净化。
3.1.2 流动相的选择
3.1.2.1 流动相组成的选择
在本实验中采用了乙腈/含0.1%甲酸的水或含0.1%甲酸的乙腈/含0.1%甲酸的水作为
流动相,使用同一色谱柱，在同一色谱条件下进行梯度洗脱分离。由图2 结果可见：使用
0.1%甲酸的乙腈/含0.1%甲酸的水作流动相的峰形与峰高优于使用乙腈/含0.1%甲酸，且能
得到更好的分离度。甲酸对青霉素类抗生素的离子化有促进作用。
STD mix (10,5,10,10,10,10,2,15)
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
-10 Time
100
%
qms[050516]STD Test001 3: MRM of 6 Channels ES+
TIC
2.36e6
15.84
16.36
17.96
STD mix (10,5,10,10,10,10,2,15)
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
-10 Time
100
%
qms[050516]STD Test002 3: MRM of 6 Channels ES+
TIC
2.56e6
15.46 15.98
17.51
图2 不同流动相对出峰效果的影响
a． 乙腈/0.1%甲酸的水作流动相 b． 0.1%甲酸的乙腈/0.1%甲酸的水作流动相
3.1.2.2 流动相洗脱梯度的确定
本文采用乙腈和水作流动相进行液相色谱梯度分离测定，试验结果见图3。可见，采
用线性可变梯度洗脱较之恒梯度（水 ：乙腈=80：20）洗脱更为合理，此条件下的六组分

的分辨率和它们的峰形明显优于恒梯度。具体梯度参数详见表1。
mix(20,10,100ng/ml) td-atlantis column
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
-10 Time
100
%
qms[050415]std002 MRM of 8 Channels ES+
TIC
4.44e5
9.88
2.98
2.21 3.36
9.08 9.41
6.94
10.32
10.93
14.36 18.71 22.01
STD mix (10,5,10,10,10,10,2,15)
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
-10 Time
100
%
qms[050516]STD Test002 3: MRM of 6 Channels ES+
TIC
2.56e6
15.46 15.98
17.51
图3 流动相洗脱梯度的比较
a． 恒梯度:水 ：乙腈=85：15 b． 线性可变梯度
3.1.3 前处理方法的摸索
3.1.3.1 样品过柱前pH 的选择
吸取1μg/mL 的青霉素混合标准溶液100μL，分别用pH=2.6、3.5、4.5、6.0、7.0、
8.5、9.2 的磷酸盐缓冲液定容10mL。溶液以1-2 毫升/分钟的速度完全过柱后，将HLB 柱
中的溶液抽干后，再用8mL60%乙腈洗脱，用定量瓶接取洗脱液。将净化后的样品溶液定
容至10mL，经0.3μm 微孔滤膜过滤后用于LC-MS/MS 测定。从测定结果可知：pH 对各组
分的峰面积无明显的影响，本文选用pH=4.5 的磷酸盐缓冲液。
3.1.3.2 洗脱液强度的选择
吸取1μg/mL 的青霉素混标溶液100μL，用PH= 4.5 的磷酸盐配成10ng/mL 的混标，
将溶液以1-2 毫升/分钟的速度完全过柱后，抽干HLB 柱中的溶液，分别用浓度为30%、
40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙腈水溶液洗脱，将净化后的样品溶液定容
至10mL，经0.3μm 微孔滤膜过滤后用于LC-MS/MS 测定。由测定结果可知：当乙腈含量
大于70%时可完全洗脱，但考虑实际情况，在90%、100%浓度下各组分的峰形较差，所以
可选择乙腈浓度为70%～80%的洗脱液。
3.2 方法学论证
3.2.1 标准曲线的制作
分别吸取浓度为100ng/mL 的青霉素混标溶液60、80、100、120、160、200μL 于
10mL 的容量瓶中，各加入浓度为20 ng/mL 的内标溶液 0.6 mL,用70%乙腈水溶液定容至
10mL，使其标准系列浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.00ng/mL，内标浓度为
1.2ng/mL,依次进样，进样量均为10μL，以标样峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，标
样浓度为横坐标分别作标准曲线，其相关系数及回归方程见表3，可见，线性相关系数均
大于0.993。
表3 六种青霉素类抗生素的线性回归方程和相关系数
组分名称 回归方程 相关系数
青霉素G Y=40.37x+0.23 0.998
青霉素V Y=27.86X+1.41 0.999
苯唑西林 Y=11.76X+0.18 0.998

氯唑西林 Y=35.27X+0.35 0.998
奈夫西林 Y=207.34x-1.69 0.997
双氯唑西林 Y=14.14x-0.001 0.993
3.2.2 检出限和定量限
当信噪比为3 比1 的溶液浓度为检出限（LOD），当信噪比为10 比1 时的溶液浓度为
定量限（LOQ），将青霉素的混合标准溶液逐步稀释至1.0ng/mL 的浓度，依次进样，各组
分在牛奶中的检出限（LOD）,定量限（LOQ）见表4，可见，定量限明显低于欧盟要求的
最大允许残留量。
表4 六种青霉素类抗生素在牛奶中的最低检出限
组分名称 LOD(μg/kg) LOQ（μg/kg）
欧盟指令2377/90/EEC 中规定
的MRL（μg/kg）
青霉素G 0.02 0.07 4
青霉素V 0.06 0.19 /
苯唑西林 0.04 0.12 30
氯唑西林 0.11 0.36 30
奈夫西林 0.02 0.08 30
双氯唑西林 0.19 0.64 30
3.2.3 精密度试验：
以牛奶加标样作为阳性样品，按2.4 要求进行样品制备。分别进样10μL, 取其平均值
进行计算。结果见表5。
表5 六种青霉素类抗生素精密度试验结果
组分名称 峰面积 RSD%
青霉素G 29682、28976、30097、27956、31897、29541 4.41
青霉素V 15121、15409、14876、13987、15959、14685 4.52
苯唑西林 23877、22987、21559、23985、24557、22654 4.68
氯唑西林 18327、19726、18995、17806、17186、18597 4.84
奈夫西林 35898、32498、34968、37056、36891、33987 5.02
双氯唑西林 16665、15986、15432、18023、16875、17587 5.76
3.2.4 回收率试验
取在精密度试验中牛奶阳性样品为试样，取样二份，每份5.00 克，每份加入相应的各
组分标样，按2.4 要求进行样品制备。分别进样10μL,结果见表6。
表6 六种青霉素类抗生素回收率测定结果
组分名称
原样中测得量
（ng）
加标后测得量
（ng）
标准加入量
（ng）
回收率
（%）
青霉素G 0.112 0.274 0.17 95.30
青霉素V 0.154 0.311 0.17 92.40
苯唑西林 0.176 0.347 0.17 100.5
氯唑西林 0.150 0.315 0.17 97.06
奈夫西林 0.132 0.286 0.17 90.59

双氯唑西林 0.249 0.412 0.17 95.88
3.2.5 干扰性试验
取未经过青霉素处理的空白牛奶，按2.4 要求进行样品制备，定容至10mL。进样，经
质谱MRM 检测，结果见图4。可见，牛奶中其它成分对青霉素的测定无干扰。
milk
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
-5 Time
100
%
qms[050518]SPE Test009 3: MRM of 6 Channels ES+
TIC
1.45e5
17.80
17.07 17.30
15.46 16.88
19.1519.32 20.99 22.99
20.36
21.38 23.30
24.09 25.84
图4 空白牛奶
3.2.6 实样测定
取空白牛奶加入青霉素混合标样和内标（最终浓度1.2ng/mL），按2.4 要求进行样品制
备，定容至10mL。进样，经质谱MRM 检测，结果见图5。
图5 牛奶加标样品图(2 ng/mL)
4 结论
本文建立了一种快速准确可靠的检测青霉素类药物的方法。
本方法主要采用LC-MS/MS 的检测手段来减少背景干扰能使检出限分别达到：青霉素
G 0.02ng/mL、青霉素V 0.06ng/mL、苯唑西林 0.04ng/mL、氯唑西林 0.10ng/mL、奈夫西

林0.02ng/mL、双氯唑西林0.19ng/mL。同时采用青霉素同位素作为内标，消除了前处理所
带来的损失，结果可靠。利用AtLantis 色谱柱能对极性化合物有效分离的特点，能同时分
离测定6 种青霉素。
采用固相萃取前处理方法，讨论了流动相中有无添加剂对灵敏度的影响，优化了样品
提取、进化的分析条件，与前人所建立的高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、柱前衍生-
离子对洗脱反相HPLC-紫外检测法相比，具有灵敏度高和回收率高等诸多优点。
5 参考文献
[1] Sara BogiaLLi.Vittorio CapitoLino.Roberta Curini.et.aL.simpLe and rapid Liquid
chromatography-tandem mass spectrometry assay for determining amoxiciLLin and ampiciLLin
in bovine tissues and miLk[J].J.Agric.Food chem.2004,52,3286-3291
[2] 《医药高效液相色谱技术》 人民卫生出版社
[3] Mark A.OLsen, PauL G.cummings,Sonya Kennedy-Gabb. The use of deuterium oxide as a
mobiLe phase for structuraL eLucidation by HPLC/UV/ESI/MS[J] . AnaL .chem. 2000.72.
5070-5078
[4] E.Verdon, P.Couedor . Deterination of isoxazoLyLpeniciLLns residues in miLk by ion-pair
high-performance Liquid chromatography after percoLumn derivatization[J]. JournaL of
Chromatography B,705(1998)71-78
[5] D.M.HoLstege B.Puschner G..Whitenead.et.aL. Screening and mass spectraL confirmation
of β-Lactam antibiotic residues in miLk using LC-MS/MS[J].
J.Agric.Food chem.2002.50.406-411
[6] Sonja Riediker and Richard H.stadLer. SimuLtaneous etermination of five β-Lactam antibiotic
in Bovine miLk using Liquid chromatography coupLed with ELectrosprayIonization Tandem
Mass Spectrometry[J]. AnaL.chem.2001.73.1614-1621.
[7] Yuko Ito, Tomomi Goto , Hisao Oka , Hiroshi Matsumoto,
Kazue Takeba AppLication of ion-exchange cartridge cLean
-up in food anaLysis VI.Determination of six peniciLLins in bovine tissues by Liquid
chromatography–eLectrospray ionization tandem mass spectrometry [J]. JournaL of
Chromatography A, 1042 (2004) 107–111

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感谢分享，就是看着感觉操作起来很复杂