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主题：【转帖】ELISA法检测配合饲料中黄曲霉素B1前处理方法的改进研究

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发表于：2010/09/21 20:24:14 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

用酶联免疫吸附测定法(ELISA)法检测配合饲料中黄曲霉毒素B (AFB )的含量，关键在于样品的前处理。本文对配合饲料中AFB，的前处理作了方法改进。结果表明：改进后的前处理方法较国标方法能显著地提高AFBI的检出量，与高效液相色谱法(HPLC)法数据一致，且改进方法加标回收理想，平均回收率为87．3％～94．5％。

黄曲霉毒素B (AFB )具有极强的致癌性和致突变性。动物采食了被AFB。污染的饲料后，可引起急性病变死亡，还可以在体内蓄积或者经新陈代谢转化成其他有毒物质在体内分布(居乃琥，1980)。人若食用了这些受AFB 污染的动物组织，健康将遭受严重威胁，因此饲料中的AFB 检测受到高度重视。AFB 易溶于甲醇、氯仿和乙腈等有机溶剂，难溶于水和石油醚(陈炳卿，2000)。由于配合饲料中组成成分复杂，且添加了一定的营养强化剂以及重金属离子(赵春城等，2003)，使得样品的前处理困难．提取过程中易出现干扰、乳化现象，导致不彻底提取。针对前处理过程中易出现的干扰。本文作了方法的改进研究。

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2010/9/21 20:24:40 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1 材料

1．1 主要试剂甲醇水溶液：量取50 mL甲醇，加50 mL水；乙腈水溶液：量取85 mL乙腈，加15 mL水：20％甲醇一PBS溶液：分别称取3．0 gNa2HP04·12H2O，0．25 g NaH2PO4·2H20，8．7 g Na-Cl，加蒸馏水定容至1000 mL；再量取80 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)，加20 mL甲醇，混匀；AFB 酶联免疫定量测试盒(江苏省苏微微生物研究所有限公司)。

1．2 设备酶标仪(奥地利Sunrise—basic)；恒温生化培养箱(日本三洋MIR一253)；高效液相色谱仪(戴安Ultimate 3000)。

1.3 样品来源本实验所用配合饲料样品均从成都地区饲料生产厂(公司)购买，共计20组，另外实验带有FAPAS (Food Analysis PerformanceAssessment Scheme)动物饲料样品。

2 实验方法

2．1 样品的提取

2．1．1 国标方法按照国标GB／T 17480—2008提取方法：称取5 g(精确至O．01 g)试样置于100mL具塞三角瓶中．加入甲醇水溶液25 mL，加塞振摇10 min，过滤，弃去1／4初滤液后收集滤液。准确吸取10．0 mL滤液经过三氯甲烷萃取后，过无水硫酸钠滤纸，水浴挥干后用l0．0 mL甲醇水溶液溶解。得到待测液。

2．1．2 改进方法称取1O g样品于磨口三角瓶中加入50 mL乙腈水溶液，加塞水封振摇20 min，过滤，弃去1，5初滤液，收集滤液于分液漏斗中，加20 mL石油醚轻微振摇，放出下层滤液，准确吸取10 mL滤液(相当于2 g样品)于125 mL分液漏斗中。加20 mL三氯甲烷加塞振摇静止分层(如分层不明显，可滴加40 g／L的NaCI溶液，振摇30 S静置，待上层浑浊变清亮为止)，放出下层，经盛有20 g预先用三氯甲烷润湿的无水硫酸钠定量过滤小柱过滤，再加10 mL三氯甲烷重复萃取3次，最后用少许三氯甲烷冲洗过滤小柱，合并滤液，放入通风橱中65℃水浴氮气吹干，准确加入10 mL 20％甲醇一PBS溶液，彻底溶解的凝结物，并用漩涡器混合均匀，此液即是AFB 提取液．适当稀释检测。

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2010/9/21 20:25:10 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2．2 改进方法的加标回收在饲料样品中分别添加浓度为：10、20 g，L和5O g，L的AFB，标准溶液，采用2．1．2中改进方法进行提取，制成提取液进行ELISA法检测。计算改进方法的加标回收率。

2．3 提取液的检测

2．3．1 酶联免疫试剂盒检测从冰箱中取出AFB，酶联免疫定量测试盒，平衡至室温，按照试剂盒要求配制实验所用的试剂：将准备好的提取液。按照说明书测定步骤进行测定。

2．3．2 高效液相色谱法比对检测将2．1．2中改进方法提取液经多功能净化柱净化，衍生后以甲醇水溶液为流动相，紫外检测器检测。

3 结果与分析

3．1 国标方法与改进方法检测数据比较见表1。从表l中看出，不同的样品前处理方法对AFB，结果的影响非常明显，改进方法比国标方法AFB。的测定值显著提高，在个别高污染AFB 的配合饲料中尤其明显。

3．2 HPLC法与ELISA法的比对检测选取表1中ELISA法测定AFB 数据较高的10组改进方法提取液，净化衍生后用HPLC法比对测定，测定结果见表2。

表2中的数据表明。采用改进的前处理方法进行提取后，EUSA法与HPLC法比对测定提取液中的AFB 数据基本一致。

3.3 国标方法与改进方法检测质控样品比较国标方法与改进方法对比测定FAPAS动物饲料

样品，数据见表3。

表1 国标方法与改进方法测定结果

表2 HPLC与EUSA比对检测数据

表3 国标方法与改进方法

测定FAPAS动物饲料样品对比数据从表3中数据可以看出。两种提取方法测定的数据都低于FAPAS的参考值，且均在FAPAS

1．1 mg／lO0 mL时。可用三聚氰酸饱和液滴定有沉淀现象显示。采用三氯乙酸和乙酸铅处理的鱼粉组滴加三聚氰酸饱和液后，无明显显示，仅见110 ms／kg试管有轻微分层界面。18 h后可见70 mg／kg到1 10 rag／kS试管均有浑浊分层面。豆粕组滴加后无明显显示，仅110呻 g试管有轻微分层界面。0．5 h后，60 rag／ks试管开始出现上层混浊物。1 h后60 mg／kg到110 mg／kg试管均出现上层混浊物。18 h后液面分层不明显，但是可见试管底部有少许沉淀生成。因此，经三氯乙酸和乙酸铅处理的样品，鱼粉和豆粕分别在70 mg／kg和60 m g有沉淀现象产生\

3．4 改进方法的回收率在配合饲料中分别添加不同浓度的AFB，标液，经改进方法提取后，

ELISA法测定回收率．数据见表4。

表4 改进方法的回收率由表4看出，改进方法的加标平均回收率为87．3％ 94．5％，加标回收理想。

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4 小结

通过本实验得知：在使用三氯乙酸和乙酸铅处理样品时，可在一定程度上去除样品中的干扰因素，提高反应的灵敏度。当鱼粉和豆粕中三氯氰胺含量≥70 mg／kg和I>60 mg／kg时，简便快捷的定性测出。

的参考区间内。但改进方法比国标方法更接近

FAPAS的参考值。

4 讨论

目前，饲料中AFB 的检测采用国家标准((GB／T 17480—2008饲料中黄曲霉毒素B 的测定酶联免疫吸附法》)，国标方法使用甲醇水溶液提取。配合饲料中含有高盐分、高金属离子(Fe 、Ca2~、M 、Cu2+、Zn 等)，在提取过程中盐分和金属离子同AFB 一起进人甲醇水溶液，使得AFB 的提取不够彻底，且容易出现乳化现象，分离净化不完全，导致检测数据偏低，造成假阴性的现象。本文中改进方法选用乙腈水溶液作为提取液，与国标法中使用的甲醇水溶液相比，其主要优点为：一是改用了极性更强的提取剂，提取率提高；二是降低提取液中水的比例，使得在提取过程中盐分和金属离子进入提取液中的量减少，在分离过程中干扰降低。实验结果显示，改进方法较国标方法更能准确反应样品实际AFB，的污染状况，且改进方法重现性好，加标回收理想。

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