主题：【第三届原创参赛】HPLC检测重组大肠杆菌BL21发酵液有机酸

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发表于：2010/10/23 18:46:04 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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HPLC检测重组大肠杆菌发酵液有机酸

有机酸的测定方法主要有: 比色法、荧光法、薄层层析法、气相色谱法、分光法和酶法等。有机酸的分析最早采用纸色谱法及薄层色谱法，它们只是半定量法，而且需要冗长的浓缩和皂化操作来进行大量样品的处理，操作十分繁琐。用气相色谱法测定有机酸，虽然较前两种方法大大改进，但样品需要经过衍生处理后才能检测，而液相色谱法可以直接测定。酶法精度高，但测定时间长。分析有机酸的方法很多，但这些方法都要经过预分离、衍生化等繁琐的前处理, 能达到同时分离的有机酸种类也较少, 远不如HPLC分析简便、快捷且选择性好, 准确度高。本文采用RP-HPLC法, 分析了类人胶原蛋白工程菌BL 21发酵过程中以葡萄糖为碳源时有机酸的种类和含量，并优化了HPLC检测条件，使其成为能同时检测甲酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸这7种有机酸的方法。

反相色谱法与本实验液相系统　

一般用非极性固定相（如C₁₈、C₈）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但值得注意的是，C₁₈和C₈使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。

本实验所用高效液相色谱仪为SHIMADZU LC-2010C HT，反相色谱柱Shim-pack C₁₈ VP-ODS （250 mm × 4.6 mm, 5 μm），紫外检测器。

液相检测条件摸索

波长选择

图发酵中有机酸全波段扫描图

Figure Full spectrum scan of organic acid

分别配制甲酸、乙酸、柠檬酸等几种有机酸标准溶液，在UV2100紫外可见分光光度仪进行扫描，结果这几种有机酸的最大吸收波长在210～220 nm围内，本研究选择UV215 nm进行实验。

流动相及浓度

考察几种常用流动相如：(NH₄）H₂PO₄-H₃PO₄、(NH₄）₂HPO₄-H₃PO₄、磷酸水溶液、硫酸水溶液、KH₂PO₄-H₃PO₄流动相。综合考察本实验，拟选择KH₂PO₄-H₃PO₄流动相，流动相浓度选为0.03mol/L，其原因是流动相浓度过高容易堵塞管路，而缓冲盐浓度过低，缓冲能力弱，流动相变化大，基线很难稳定。

pH

流动相的选择依据，流动相的pH值的主要取决于被分离的有机酸的pKa值，乙酸的解离常数是4.76，柱子能承受的最低pH值是2，在酸性流动相环境中，如果允许乙酸有1%的离子状态存在，则可预测流动相的pH值。

pH = pKa + Log [Ac^-]/[HAc] = 4.76 + Log 1% = 2.76

由式可知，流动相的pH值应该是pH 2~2.76之间。配制pH=2.2，2.4，2.6，2.8四种梯度流动相，最后选择pH=2.8的流动相。pH值越小，酸的解离越少，峰形越好。反相C₁₈柱的容许pH范围2.0～8.0，而且磷酸盐在2.8处缓冲容量最大（由于篇幅所限，液相条件探索的色谱图省略处理）。

温度

有机酸在水溶液中存在离解平衡，温度升高时会增加溶质的离解，保留时间减少，但不利于有机酸的分离，当温度超过25˚C时各有机酸分离效果较差。因此，本实验选择柱温25˚C。

乙腈添加量（有机改性剂）

在流动相中加入少量乙腈 ,能有效的改善峰形。以0.03mol/ L 的K₂HPO₄（pH 2.8）溶液作流动相，对不同的甲乙腈含量（0，1 %，2 %，3 %，5 %，10%）对色谱分离的影响进行了比较，结果表明：乙腈添加量少，峰拖尾严重；乙腈添加量多，峰分离度下降，峰重叠。随着流动相中乙腈含量的增加，有机酸的疏水端基与固定相的相互作用减弱，保留时间下降，2%的乙腈缓冲溶液（V/V）分离度和峰形较好。

流速

实验对流动相流速分别为0.8mL/min，0.9mL/min，1.0mL/min，1.1mL/min，1.2mL/min 时的实验结果进行了比较，结果表明流速为 0.9mL/min 时效果较好。流速过大，酸的分离度减小，影响其检测结果；流速过小，分析时间延长，且琥珀酸的峰形不好，成馒头峰，也影响测定结果。

液相检测

流动相的配制

（1）溶液A：用磷酸盐缓冲液（H₃PO₄+KH₂PO₄）将超纯水调节pH至2.8

（2）流动相：乙腈：溶液A=2%：98%

（3）将配好的流动相置于溶剂过滤器中过滤，然后在超声波清洗器下进行超气。

样品预处理

（1）取1ml发酵液10,000r/min离心5min；

（2）取上清0.5ml,加入0.3gNaCL, 0.10ml 2.3mol/L H₂SO_4,2.50ml乙醚，在振荡器上混合1min，5,000r/min 离心3min；

（3）取乙醚相1.00ml,加0.20ml0.1mol/LNaOH混合1min，5,000r/min离心3min,吸去上层乙醚，用试纸测试pH>9（在酸性条件下，用乙醚萃取，将有机酸以分子形式萃取到乙醚相中，再在pH>9的条件下反萃取到水相中，可大大去除其他物质的干扰），开盖挥发乙醚相后，置干燥器内干燥；

（4）加入2.5ml 0.02mol/LKH₂PO₄（pH2.8）溶解，10,000r/min离心10min；

（5）取1.5ml0.45µm膜过滤注入样品瓶，取5μl进样分析。

保留时间的确定

选取发酵液中可能产生的有机酸如甲酸，琥珀酸，乙酸，柠檬酸，酒石酸，各取2%标准溶液进样分析，测定各有机酸的保留时间分别为：甲酸3.735min，L-苹果酸 4.266 min，乳酸5.239min，乙酸5.739 min，柠檬酸7.805 min，琥珀酸9.502 min，丙酸13.871min。

图标准有机酸色谱图

Figure Chromatogram of a mixture of organic acids standards

有机酸标准曲线的绘制

精确量取色谱纯的乙酸2.0g，各种有机酸（分析纯）：甲酸0.8g、L-苹果酸0.4g、乳酸0.8g、柠檬酸4.0g、琥珀酸0.4g、丙酸1.2g配制成混合标准溶液。随后稀释成5种梯度的标准混合液，分别含有乙酸0.2g/L，0.2g/L，0.5g/L，1.0g/L ,1.5g/L，2.0g/L。按照前述萃取方法进行萃取后，5μl进样分析。

用有机酸浓度（X）对峰面积（Y）做线性回归分析，得到各种有机酸线性方程。表1， 2列出了各种有机酸的标准曲线、检出限、精密度及回收率

每份样品进行5次平行测定，考察方法的回收率和精密度，以峰面积对质量浓度C（g/L）求得线性回归方程，以3倍信噪比（S/ N）计算最小检出限量，结果见表。可见该方法定量准确灵敏、重现性好、回收率高。

表1 标准曲线的线性参数

Table 1 Linear equations of the standard curves

成分	回归方程	r	线性范围（mg/L）
甲酸	y = 113773x - 4590.8	0.9957	35～6005
L-苹果酸	y = 29896x - 71.346	0.9983	38～6856
乳酸	y = 47866x + 322.37	0.9998	15～15050
乙酸	y = 70341x - 245.19	1.0000	10～25056
柠檬酸	y = 4775.7x + 756.27	0.9989	58～7508
琥珀酸	y = 44948x + 459.78	0.9992	15～15000
丙酸	y = 84568x + 388.9	0.9993	70～25000

表2回收率和精密度实验结果（n = 5）

Table 2 Results of recovery and precision ( n = 5)

成分	检出限（mg/ L）	RSD（ %）	回收率（ %）
甲酸	0.50	0.40	99.2
L-苹果酸	0.50	0.31	100. 1
乳酸	0.54	1.16	98. 2
乙酸	0.73	1.10	97. 9
柠檬酸	0.50	0.96	99. 5
琥珀酸	2.00	1.53	99. 6
丙酸	2.30	1.20	98.5

进样分析
取各发酵时段的培养液，按样品处理方法进行样品处理后，进行HPLC测定，得到培养过程中有机酸随发酵过程的变化曲线。摇瓶发酵有机酸谱图和发酵罐发酵有机酸谱图如下：

图萃取摇瓶发酵液中有机酸图谱

Figure 3 The chromatogram of organic acid in fermentation liquor by shake flask culture

图4 萃取发酵罐发酵液中有机酸图谱

Figure 4 The chromatogram of organic acid in fermentation liquor by fermentor culture

HPLC检测有机酸方法小结

从摇瓶发酵有机酸图谱中我们可以看出这七种有机酸得到很好的分离效果，但发酵罐发酵干扰物质比较多，在样品萃取后干扰峰仍然比较多，但几种主要酸的峰分离效果较好（乙酸、柠檬酸、丙酸等），证明了HPLC方法快速灵敏的分析可对工程菌发酵条件的优化进行指导, 采取相应的控制措施尽可能减少生长和基因表达的抑制因素, 并为高密度发酵中有机酸的在线控制提供可行的方法。