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主题：【资料】高速逆流色谱介绍---工作方法

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jia

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发表于：2010/10/27 16:39:12 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（一）、高速逆流色谱系统的组成

高速逆流色谱系统主要由溶剂泵、进样阀、色谱柱、检测器、色谱工作站以及馏分收集器组成。与普通高效液相系统相似，如果把HPLC的色谱柱部分用一台HSCCC螺旋管式离心分离仪替代，就可构成一台高速逆流色谱系统。由于HSCCC的柱系统是由在高速行星式运动的螺旋管内的两相互不相溶的液体构成，其中一相作为固定相，另一相作为流动相，待分离的物质根据其在两相中的分配系数的不同，在通过两相对流平衡体系的过程中实现分离。分离效果与所选择的两相溶剂系统、固定相与流动相的选择、仪器的运转参数（包括转速、转向）、洗脱的速度与洗脱方式、进样量与进样方式等多种因素密切相关。因此，在采用逆流色谱分离时，其操作方法和工作程序等方面都有独特之处。

高速逆流色谱系统对所用的输液泵的要求要比HPLC低的多，通常柱系统所产生的压力要小于1MPa，所以一般的恒流泵即可满足要求，如上海同田生物技术公司生产的TBP系列双柱塞恒流泵，北京圣益通技术开发有限公司生产的S系列单柱塞恒流泵，在国产逆流色谱系统中经常使用。

HSCCC分离过程可以连接多种检测器，进行在线检测，而最常用的是单波长或多波长的紫外-可见光检测器（UV-VIS）。也可以借用制备型液相的检测器（如二极管阵列检测器（PDA））。在HSCCC分离中，通常会因固定相的流失或气泡，造成色谱曲线出现毛刺。通常可以通过优化体系、控制流动相温度或在检测器的出口加一个细管来产生一定的反压、溶剂体系使用前超声处理，来抑制气泡的形成。

对于没有紫外吸收的样品，可以采用近年来发展起来的蒸发光散射检测器（evaparative light scattering detector, ELSD）进行在线检测。由于ELSD的检测对样品是破坏性的，所以在制备型CCC中要通过分流管进行分流。目前HSCCC-ELSD技术已经应用在皂苷^[22]等物质的分离。

质谱是近年来得到迅速发展和广泛应用的分析检测技术，它能够有效提供化合物的分子结构信息。现在已出现了HSCCC与电子电离质谱(EIMS)、化学电离质谱(CIMS)、快速原子轰击质谱(FABMS)、热喷雾质谱(TSPMS)和电喷雾质谱(ESIMS)的联用^[23~25]。由于MS的检测对样品是破坏性的，所以在制备型CCC中也要通过分流管进行分流。Chen等^[24]采用HSCCC与MS在线联用，并成功应用于黄酮的分离和检测。

（二）、高速逆流色谱溶剂系统选择与优化

对逆流色谱分离效果产生影响的因素, 主要包括溶剂系统和仪器操作参数这两个方面。溶剂系统选择是否得当，是影响HSCCC分离的关键；而高速逆流色谱仪的转速、流动相流速、进样体积也是影响分离的重要因素。

溶剂系统的选择和优化是一项复杂和艰巨的工作，是逆流色谱分离工作的难点，也是样品能否成功分离的关键，通常会占去整个分离工作40~90%的时间。虽然目前对溶剂体系选择的方法和评价体系较多，如Foucaut的三元溶剂体系，Oka、Ito、Abbott等、Berthod^[、张莉等的多元溶剂体系的筛选方法，但是，这些选择溶剂体系的理论和方法的系统性和理论性还不完善，完全据之进行实际操作还存在问题和困难。

一般来说，两相溶剂系统应满足如下几个要求：①不造成样品的分解或变性，并有足够高的样品溶解度；② 溶剂系统的分层时间小于30秒，以保证固定相保留值尽可能不低于50%，③ 目标化合物在两相溶剂系统中的分配系数在0.5~2之间；④溶剂易挥发，以方便后续处理。

在选定溶剂系统的基础上，还要对仪器的转速、流动相的流速、进样量等参数进行优化，根据实验结果总结的基本规律是：① 转速越高，越易产生乳化现象。② 流动相流速越大，固定相流失加重。③ 进样量太大，峰间距变窄，峰形变宽。④进样体积通常不大于总柱体积的5%，在制备型逆流色谱中，通常使用上下相等体积溶解样品，在分析型HSCCC用流动相溶解样品。在选定了溶剂体系后，有时需要对三个仪器运行参数(转速，流动相流速，进样体积)进行正交试验，以确定最佳分离条件。

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2010/10/27 23:21:29 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

楼主的内容好丰富啊，以附件的形式贴出来会更好吧呵呵

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2010/10/28 10:16:08 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 阿三(junqiwudi) 发表:
楼主的内容好丰富啊，以附件的形式贴出来会更好吧呵呵

不好意思，我们实验室正在一步步总结，等总结完了，再把全套以附件的形式内容发上来。

该帖子作者被版主 kaikaifeng加 2积分， 2经验，加分理由：阁下若是有兴趣，可以考虑来本版面当专家啊

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2010/11/3 12:22:25 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 jia(jia) 发表:
原文由 阿三(junqiwudi) 发表:
楼主的内容好丰富啊，以附件的形式贴出来会更好吧呵呵

不好意思，我们实验室正在一步步总结，等总结完了，再把全套以附件的形式内容发上来。

期待中，辛苦啦

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2010/11/4 13:52:04 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

Foucaut的三元溶剂体系，Oka、Ito、Abbott等方法不是很明白，可否详细说明

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2010/11/4 15:18:26 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 ruby70303(ruby70303) 发表:
Foucaut的三元溶剂体系，Oka、Ito、Abbott等方法不是很明白，可否详细说明

通常认为几元体系就是又几种溶剂配成的，三元体系就是三种溶剂配成，多元体系就是多种溶剂混合而成，通过调整不同极性溶剂的比例调整分离效果。至于三元及多元体系的不同应用，已有大量文献报道。逆流体系的选择往往跟经验关系很大，因为它相当于同时选择色谱柱和流动相。经过我们的研究，以目前绝大多数化合物为基础，四元体系（石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水）的适用情况要优于三元及超过四元体系的其他多元体系。

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2010/11/4 15:25:14 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 jia(jia) 发表:
原文由 ruby70303(ruby70303) 发表:
Foucaut的三元溶剂体系，Oka、Ito、Abbott等方法不是很明白，可否详细说明

通常认为几元体系就是又几种溶剂配成的，三元体系就是三种溶剂配成，多元体系就是多种溶剂混合而成，通过调整不同极性溶剂的比例调整分离效果。至于三元及多元体系的不同应用，已有大量文献报道。逆流体系的选择往往跟经验关系很大，因为它相当于同时选择色谱柱和流动相。经过我们的研究，以目前绝大多数化合物为基础，四元体系（石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水）的适用情况要优于三元及超过四元体系的其他多元体系。

看来做这方面，条件摸索经验很重要啊。

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