主题：【资料】质谱法 液相色谱柱知识

3 电喷雾萃取电离技术（Extractive Electrospray Ionization）

陈焕文等在进行DESI-MS研究的基础上，创造性地提出了电喷雾萃取电离（EESI）技术。EESI 技术最早用于液体样品的测定，由电喷雾产生的带电液滴及离子与雾化产生的样品液滴碰撞，样品溶液中的待测物被萃取出来并电离，待测物离子由毛细管接口引入质谱仪。

质谱图
随后，陈焕文等成功地开展了基于 EESI-TOF-MS 方法和活体呼吸气体为样品的代谢组学方面的研究，研究结果被 Angew. Chem.杂志选中为VIP热点文章、并以封面配图的形式加速发表。实验在商品化ESI离子源上进行，气体样品由鞘气入口引入，与电喷雾产生的带电液滴及离子碰撞，待测物分子被萃取并离子化后，由毛细管引入质谱仪。因其别具匠心的设计和优异的性能，使得 EESI-MS 不仅具有质谱特有的高灵敏度和高特异性，而且能够承受各种形态的样品，而且不需要进行样品收集和分离，能够对生物样品进行活体、实时、在线分析。因此，给临床样品的快速质谱分析这一问题的解决提供了可能。从已经发表的结果来看，EESI-MS 不但能够检测呼吸气体中含有的极性分子和非极性分子，而且还能够检测挥发性和非挥发性分子。通过呼吸气体的活体在线的质谱分析，在1秒钟内即可以获得样品中所有这些分子的指纹谱图，而且可以对任何感兴趣的组分进行结构鉴定，确保了测量结果的可靠性。他们的研究结果表明，人体在极端饥饿或病理条件下将能够在呼出气体中检测到超乎寻常的大量尿素，这与体内采用蛋白质、脂肪来代替糖类供能的结果吻合，也给许多疾病的诊断提供了依据；当服用甜点后能够在呼出气体中检测到葡萄糖，为糖尿病等的诊断和研究提供了新的途径；数据也清楚地显示了健康亚洲人和欧洲人身体对啤酒的不同反应；并且展示了通过选择性分子-离子反应来进行某一类化合物的快速测定，比如口臭患者病因的检测等。实际上，EESI-M 可看作是分子水平上的闻诊。根据科学家的评价，该项研究结果清楚地展示了如果应用质谱仪来进行活体代谢组学研究，对人类多种疾病的诊断、治疗以及对生命活动的分子细胞学机制的研究提供前所未有的有效工具。2002年诺贝尔化学奖得主、ESI技术发明人John B. Fenn 教授认为这一技术（EESI）将被广泛应用，尤其是分析化学家将满怀感激，对此，毫不怀疑。Cooks 教授认为 EESI开辟了临床诊断分析化学研究的新领域，对质谱学在临床医学方面的应用具有划时代的意义。该研究成果发表后，瑞士化学会会刊CHIMIA立即决定对其进行转载，欧美各国的众多学术期刊，包括英国Chemistry World，美国 C&EN，德国科技在线，Medical News Today，Medilexicon，Hospitalsworldwide，Lab on a chip等媒体都以多种文字对此成果进行了报道，意在迅速引起各国相关行业人员的关注。

质谱-新型离子检测技术       
1 低温检测器

低温检测器也叫热量检测器。当粒子或离子撞击超导薄膜表面，能量累积并产生热量，表面溅射出中子、离子、电子和光子，这个过程在常温下不容易被发现。然而，在低温条件下（<3K），能够检测到由离子撞击产生的瞬间“高温”，从而提供离子速率和能量的信息。低温检测器具有100％的效率、无质量岐视、理论上无质量上限。使用电子倍增器和微通道板对大质量离子进行检测时，由于二次电子的产生会使检测效率降低，而低温检测器在高质量区响应信号不会下降。

液质联用
这种能够对离子能量检测的方法有助于对离子化机理的研究。2002年出现商品化的采用超导隧道结检测器的阵列低温检测器，对 m/z400，000 大分子进行检测，灵敏度达 fmol 水平。但是，这种检测器需要工作在极端低温的环境下，在一定程度上限制了其推广应用。

2 微球板检测器

Tremsin 和 Naaman 等研制出基于微通道板检测原理的微球板检测器（MSP）。直径约为 20～100 微米的玻璃微球经特殊材料处理后，烧结形成薄的、多孔玻璃板，这样在玻璃板两个表面之间就可形成不规则通道，离子撞击玻璃板表面产生二次电子被加在两表面间的高压加速，通过弯曲的通道时，再次撞击其他微球表面产生更多的电子，经多次循环产生后，电子流在玻璃板的另一侧得到检测。与微通道板相比，微球板有更高的检测效率。使用微通道板时，当离子撞击在通道之间的表面，不产生电子；而使用微球板时，接收离子的表面为多个球表面，这极大地提高了检测效率。另外，与微通道板相比，微球板的成本要低的多。

质谱仪Guilhaus 等将微球板检测器与正交飞行时间质量分析器联用时，单个离子的脉冲宽度为800ps（半峰宽）。

3 其他

Birkinshaw和Langstaff等人研制出由微通道板和阳极阵列组成的聚焦板检测体系。阳极阵列是基于芯片技术的互补型金属氧化物半导体器件，由 18 微米宽的铝检测带和相应电路组成，可用来检测微通道板产生的脉冲电流。与普通微通道板相比，信噪比、灵敏度、分辨率得到一定提高，而计数速率没有得到改善。

Sinha 和 Wadsworth 等报道了基于电荷耦合器件（CCD）的阵列检测器，作者将电荷耦合器件中对光子敏感的器件换成金属氧化物半导体器件，可直接用于离子的检测，灵敏度较高，可检测 5 个离子。

Fuerstenau 等将主动象素传感技术用于离子的检测，将可用于电荷收集的金属带代替互补型金属氧化物半导体器件中的光电二极管。与电荷耦合器件不同，互补型金属氧化物半导体器件中的每个象素在电路中都有独立的放大功能。

质谱-展望       
进入 21 世纪，现代科学技术的发展对分析测试技术提出了新的挑战。与经典的化学分析方法和传统的仪器分析方法不同，现代分析科学中，原位、实时、在线、

质谱应用非破坏、高通量、高灵敏度、高选择性、低耗损一直是分析工作者追求的目标。在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。电喷雾解吸电离技术、电晕放电实时直接分析电离技术和电喷雾萃取电离技术的提出，满足了时代的需要，满足了科学技术发展的要求，为复杂样品的快速质谱分析打开了一个窗口。

便携式质谱仪是近年来新型质谱仪的研究热点之一，便携式质谱仪的研究主要集中在离子化技术、质量分析技术方面，检测器多采用 Detech 公司和 SGE 公司的商品化检测器。为适应离子化技术、质量分析技术的快速发展，开发高性能离子检测技术已迫在眉睫，而低噪音、高稳定性、宽质量范围、较低的质量岐视、长寿命、低成本将是离子检测技术发展中所要追求的目标。

质谱和光谱、核磁共振等方法是并列关系，目前很少有交叉领域。实际上，质谱和这些经典谱学方法之间的交叉，也是应该值得重视的研究领域。

质谱-参考文献       
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色谱柱知识
+ 1 　前　言

液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样 品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各 种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关 键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响 目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程 中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护色谱柱的知识非常必要。 色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压 力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致 鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有:

(1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子 表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在双 分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在 流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟 基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。当硅羟基 对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱 效下降,峰形出现拖尾、变宽。

(2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度 多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金 属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使 其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶素和 大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧 化,影响其分离效果。

(3) 碳流失。固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。

(4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时,有 时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后,如果 没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将 柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。

(5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当,使 色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色 谱柱的损伤,影响分离效果。

2 　色谱柱的使用

新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。 认真阅读说明书及性能测试报告,了解新柱子的最 佳性能指标,如某色谱条件下的柱压、柱效等。有时 分析用的流动相与柱子的保存试剂不同,故在分析 样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂 清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18 柱通过出厂测试后多保存在乙腈 中,可用10～20 倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱
柱。流速要缓慢提高,如开始0. 3～0. 5mL/ min , 10～15min 后可慢慢加快。硅胶柱和极性色谱柱通 过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需 要使用含水的流动相,则使用前须用乙醇或异丙醇 冲洗,流速0. 1～0. 3mL/ min ,将正庚烷冲洗干净 后,再用流动相平衡。实验过程中可以记录色谱柱 的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。 每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平 衡,待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱用初始流 动相平衡。一次样品分离完成后,要有足够的时间 使系统恢复平衡,再进行下一次分析。一般流动相 平衡时间为30min ,若系统中有盐或水,平衡时间应 延长。

3 　色谱柱的清洗与保存

色谱柱清洗是日常的重要维护工作。如果样品 分子残留在柱子、接头、流通池中,会污染系统,影响 对其它样品的分析,降低柱效。因此分析工作结束 后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用 90 %甲醇冲洗30～60min ,若含酸、碱、盐类物质,则 要先用10 %甲醇或乙腈,或用与分析用流动相相同 的比例把含酸、碱、盐溶液换成水,冲洗30～60min , 再用50～70 %甲醇或乙腈冲洗,最后用100 %甲醇 或乙腈冲洗。若有四元泵,可用梯度达到90 %的甲 醇冲洗。直接用纯甲醇或乙腈冲洗,会导致磷酸盐 沉淀于柱子或检测池中。最好也不要用100 %纯水 冲洗柱子。纯水极性很强,ODS 填料的硅烷键是非 极性的,在纯水中各键合基团会因疏水而改变性能, 使柱效很快降低。目前已有公司推出可以使用 100 %纯水的柱子,原理是键合基团互相之间有排斥 力,阻止了键合基团性能的改变。能否用纯水冲洗 要看柱子说明书的规定。 有机相(如甲醇、乙腈) - 水体系流动相能完成 大部分析工作,但是有时分析弱酸或弱碱化合物时(如生物碱) ,为消除拖尾现象,需用离子对试剂。常 用的离子对试剂有庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠, 这时常采用p H3～5 的缓冲盐体系。离子对色谱分 离结束后,柱子应先用有机溶剂- 水体系冲洗,再用 水冲洗,最后用有机溶剂冲洗。假设流动相是甲醇- 0. 5 %庚烷磺酸钠(p H3. 3) (VnV = 50n50) ,应先 用50 %的甲醇水冲洗,然后用水冲洗,最后用甲醇 冲洗。这是因为十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠都是表面活性剂,可以洗掉脂肪油(如烷烃及其衍生物) 。 如果先用水冲洗,十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠会 将ODS 柱胶表面键合的长链烷烃洗脱下来,造成固 定相的损失。如果先用有机相- 水体系冲洗柱子, 由于表面活性剂在有机相中有一定的溶解度,并且 流动相的量比较大,会命名表面活性剂逐渐溶解在 流动相中被冲洗出来,从而减少表面活性剂对键合 相的洗脱。十二烷基硫酸钠和庚烷磺酸钠冲洗干净后,可以再用水冲洗,然后用有机相冲洗和保存。不 同型号色谱柱冲洗所用溶剂体积见表1 。
表1 　色谱柱冲洗溶剂体积
色谱柱尺寸(mm)          柱体积(mL)          溶剂体积(mL)
125 ×4                      1. 6                30
250 ×4                      3. 2                    60
250 ×10                    20                      400

色谱柱一般用流动相中所含的有机溶剂来清洗 与暂时保存,若长期不用,要用色谱柱说明书中推荐 的溶剂保存。如反相色谱柱可用纯甲醇或乙腈保 存,正相柱用烃类溶剂保存,离子交换柱用水或甲 醇/ 水保存

色谱柱的再生

若色谱柱柱效严重下降,分离效果变差,可以用10 %异丙醇甲醇冲洗色谱柱。若柱效仍无改善,可以对色谱柱进行再生。色谱柱再生时,最好使用廉 价的泵,而不使用高效液相色谱仪上的泵。

再生的关键是了解污染物的性质,并找到合适 的溶剂将其去除。如果污染是因强保留物质的累积 引起的,可以用流动相中较强的溶剂(90 %～100 %) 以相当于20 个柱体积的溶剂量清洗污染物。残留 的脂质能用非水溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃清洗。 如果使用的是缓冲液系统,则要先用无缓冲流动相 (即把缓冲液换成水) 以相当于5～10 个柱体积的量 冲洗,再更换强溶剂继续冲洗。但有时强溶剂也无 法将残留在色谱柱上的污染物洗掉,需要使用更强 的溶剂或者多种溶剂清洗柱子。对于含蛋白质类的 污染物,用0. 05mol/ L 稀硫酸冲洗非常有效,流速0. 5mL/ min 。溶剂与溶剂之间的组合有很多,有时 生产厂家会推荐溶剂系统。清洗、再生所用的系列 溶剂都是强度逐渐增加的,通常最后一个溶剂是疏 水的(如醋酸乙酯甚至是烃) ,可以用来溶解非极性 物质,如脂质和油类。清洗过程中必须保证冲洗溶 剂之间的互溶性,清洗过程结束时,必须借助中等强 度能互溶的中间溶剂回到初始溶剂系统。异丙醇是 一种非常好的中间过渡溶剂,既能与正己烷或二氯 甲烷互溶,又能与水相溶剂互溶。但异丙醇粘度非 常大,必须在较低的流速下使用,以免泵压过高。一 般情况下,极性固定相(如Si , N H2 , Diol 基色谱填 料) 的再生可以依次使用20～30 倍色谱柱体积的正 已烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇冲洗色谱柱(因异丙醇 的粘度较大,冲洗过程中随时注意调整冲洗流速) , 然后再以相反的溶剂顺序冲洗色谱柱。非极性固定 相(如反相色谱填料C18 ,C18 ,CN 等) 的再生可依 次用20～30 倍柱体积的甲醇n 水= 10n90 (V/ V) 、 乙腈、异丙醇冲洗色谱柱,然后再以相反顺序冲洗色 谱柱。键合型的离子交换柱可以用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。例如,典型的硅胶键合柱,在没有缓冲溶液的 情况下,可以用甲醇、乙晴n 异丙醇= 75n25 (V/ V) 、异丙醇、二氯甲烷、正己烷依次冲洗。用二氯甲 烷或正己烷中洗后,考虑到溶剂相容性,柱子必须再 用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。四氢呋喃 是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果柱 子被严重污染,可以用二甲基亚砜(DMSO) 或者二 甲基甲酰铵和水按50n50 的比例混合,用低于0. 5 mL/ min 的流速冲洗色谱柱。对N H2 改性的色谱 柱进行再生时,由于N H2 可能以铵根离子的形式存 在,因此应该在用水冲洗后用0. 1mol/ L 的氨水冲 洗,然后再用水冲洗,直至碱溶液完全流出。 另外,大多数强保留污染物都会累积在柱头上, 对柱子反冲可以缩短冲洗时间。当然还要看所用色 谱柱是否允许反冲。无论正冲还是反冲,最好不要 接检测器,以免污染物进入检测池。 污染物的过多累积会加大清洗难度,清洗柱子频率越高越容易清洗,所以有规律地清洗柱子,可以 预防重大问题的发生。 污染严重的色谱柱冲洗无效时,需将柱内填料 取出进行处理,或更换新填料。还可以将柱头入口 处被污染的填料取出,重新补装同类型的填料,然后再改变柱流向进行再生。这种逆流再生方法,可以 使大多数柱子性能得到恢复。

5 　色谱柱的维护

色谱柱使用过程中不能碰撞、弯曲或强烈震动。当柱子和色谱仪连结时,阀件或管路一定要清洗干 净。以下从流动相、样品、保护柱等方面提出色谱柱 维护应注意的一些问题。

(1) 流动相: 流动相使用前必须经脱气和过滤处理。即使仪器配有自动脱气机,也最好采用超声 脱气或其它简便的脱气方法对流动相进行预脱气。尽量避免使用高粘度溶剂(如异丙醇) 作为流动相, 避免流动相组成及极性的剧烈变化。流动相应尽量 使用色谱纯,减少流动相中杂质对色谱柱的污染和 对检测器的影响。水用超纯水, 流动相最好用 0. 45μm或0. 22μm 的膜过滤。大多数反相色谱柱 的p H 稳定范围是2～7. 5 ,硅胶柱p H > 8 时会发生 硅胶溶脱,键合型柱p H < 2 时会发生键合相断裂, 流动相尽量不超过色谱柱的p H 范围。普通C18 柱 尽量避免在40 ℃以上的温度下分析。柱内不溶物 容易引起色谱柱的堵塞,影响样品的分离。不溶物 产生的原因是有溶剂的不互溶、样品溶解液和流动 相不互溶或者由于温度改变或固定相干涸而产生沉 淀。为避免上述问题,要注意溶剂之间的互溶性。若两种溶剂不互溶,需经过中间溶剂慢慢过渡。保 存时应将色谱柱两端密封,并尽量保持室温恒定。

(2) 样品: 对内径5μm 的柱子, 样品需经 0. 45μm的膜过滤,更细的柱子要0. 22μm 的膜过 滤。基体比较复杂的样品需经过一定的样品预处 理,例如海洋沉积物、中药提取液、体液等,需要采用 萃取等方法除去对柱子有损坏的较大杂质,例如色 素、多糖、蛋白质等。尽量减少进样量,避免过载。

(3) 保护柱:最好使用预柱作为保护柱,减少污 染物对分析柱的损伤。压力升高通常是需要更换预柱的信号.

哇 好多啊，还是要捡重点看。