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紫外可见分光光度计（UV）

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仪器社区 > 光谱 > 紫外可见分光光度计（UV）帖子详情

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主题：【第三届原创大赛】由测试DNA样品而引发的思考

浏览0 回复18 电梯直达

夕阳

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发表于：2010/11/24 14:15:36 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

该帖子已被xiaoanxiaoye设置为精华；

近日，修理一台紫外可见分光光度计，感觉颇有意思，特记录下来与诸君分享。
故障：
使用者反映，在测试DNA样品时，其测试值重现性不良。故怀疑是仪器的故障。
检查：
（1）仪器为双光束分光光度计，采用多波长的测量方式，分别设定为280nm和260nm二个DNA的特征波长。样品比色皿采用了微量比色皿(50微升)，如下图-1：

图-1 微量比色皿

（2）DNA样品采用固定一个，为的是保证测试结果的同一性。
（3）仪器预热并用空气调零后开始测DNA样品，步骤是：测完一次后将样品从样品室中取出，间隔几十秒钟后再次放入仪器中测试；这样周而复始地连续测量十余次，结果测量的吸光值的确呈逐渐变大的趋势。
（4）为了证实仪器是否有问题，参比一侧以空气做空白；在测量样品的间隔中，测量空白（空气）值，以观察仪器是否漂移。其结果见附图-2：

图-2 测量结果

（5）从测试结果看，WL1和WL2的零点分别在0.000~0.004Abs和0.010~0.014Abs间变化；
而WL1和WL2的测试值却呈现逐渐走高的趋势，分别为0.279~0.432Abs和0.359~0.511Abs。

结论：仪器没有问题，而是DNA样品本身的问题。

思考：
（1）DNA样品的这种走高现象我以前也遇到过，曾考虑是样品遭到氧化的原因。
（2）这次我的推论是：DNA样品极易形成分子团并吸附在比色池的池壁上，随着时间的推移，吸附在池壁上的DNA越来越厚，吸光值自然也就逐渐加大了。
（3）因此，如何解决快速测量及添加稳定剂就是一个很好的研究课题。
（4）这种现象也会发生在原子吸收上，尤其是采用石墨炉测试Pb时，同一个样品杯里的样品上午和下午的测试结果相差很大，关于这点许多专著上均有解释，那就是：铅的样品极易被吸附在样品杯壁上，于是进样器吸取的样品浓度会逐渐变低，自然其测试值随之逐渐减少了，这也就是为何原吸样品中添加硝酸的原因了。但是这种在比色方法中的吸附影响，不知有无专著解释过？

后记：
虽然文章仅有寥寥五百来字，但我认为其内容可能还算是值得借鉴的吧？仁者见仁智者见智，欢迎大家拍砖。

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2010/11/24 14:44:52 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

看来，anping老师判断仪器的稳定性，是看空白值的稳定性。

恩，学习了。

anping老师，你这个仪器是什么型号呢？

因为，我前修的那个UV765,吸光度值显示0.0000Abs。小数点后4位。

透过率可以显示100.00%，也是小数点后2位。

UV765的双光路，有点特殊，晚上我另开一贴，您看看。虽然UV765是双光束，不过出狭缝时（单色器内部），光被分为两路。在样品室中，只能看到一个光束。
这种情况多见吗？毕竟，我见双光束仪器见的少。

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2010/11/24 14:45:41 Last edit by nemoium

夕阳

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2010/11/24 14:50:21 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 祥子(nemoium) 发表:
看来，anping老师判断仪器的稳定性，是看空白值的稳定性。

恩，学习了。

anping老师，你这个仪器是什么型号呢？

因为，我前修的那个UV765,吸光度值显示0.0000Abs。小数点后4位。

透过率可以显示100.00%，也是小数点后2位。

UV765的双光路，有点特殊，晚上我另开一贴，您看看。虽然UV765是双光束，不过出狭缝时（单色器内部），光被分为两路。在样品室中，只能看到一个光束。
这种情况多见吗？毕竟，我见双光束仪器见的少。

我检修的仪器是U-2800型的。小数点也可设到0.0000Abs，但是到了小数点的后四位，我认为没有身边么意义了。您看呢？
这种情况是指测DNA的变化吗？

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2010/11/24 15:15:20 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

不是，是说这种双光路这样布局的情况。

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夕阳

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2010/11/24 15:44:36 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 祥子(nemoium) 发表:
不是，是说这种双光路这样布局的情况。

奥，明白了，你说的就是那种所谓的“准双光束”一类的仪器。机内那束参比光仅作为防止灯漂移而设计的参照信号。
对扣除样品中的背景是无能为力的，说穿了，本质上还是单光束的仪器。这类仪器以国产仪器居多。

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jelly98

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2010/11/24 20:59:48 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

分析的不错，据我所知DNA样品稳定性较差。

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初学者&九点虎

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2010/11/24 22:09:29 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

安老师提高说DNA暴露在空气中氧化，我们做酶学实验的时候，加完样品后用封口膜把比色皿上表面糊起来，是否能在一定程度上起到隔绝空气的作用。

但也有一个问题，液面和封口膜之间还是有空气存在的，如果更严格的话，是否可以考虑稍微氮吹一下，再加封口膜

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tutm

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2010/11/25 11:24:59 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

这个情况应该不是溶质分子在比色皿壁上吸附造成的。

因为如果溶质分子在内壁吸附，会降低溶液浓度，但在光通过的两面壁上吸附的分子仍然会吸收光线能量，应该影响不大；但是在侧面壁上吸附，它对吸光度没有贡献了。因此，综合起来的结果应该是吸光度逐步下降才合理。

这个现象正好做动力学测试，说不定他们还可以有新发现啦。

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