进样量小也易造成进样重复性差,采用内标法较外标法的结果更为准确。 顶空进样法是将大量样品中的残留溶剂富集在顶空瓶上层的气体中,对绝大多数有机溶剂而言,灵敏度较直接进样法大为提高,但顶空进样系统中存在气液两相的平衡问题,对结果准确性的影响因素增多。评价方法是否合理,应着重关注以下三个方面:
(1)顶空条件:顶空瓶的平衡温度和时间是最重要的参数,根据溶解样品的溶剂和待测溶剂的不同性质,达到气液平衡所需的温度和时间可能不同,应有试验数据作为选择的依据,但在申报资料中一般都未提及。判断顶空条件是否适用,一般的规律是:顶空瓶的平衡温度应低于溶解样品所用溶剂的沸点10℃以下,能满足检测灵敏度即可;对于沸点过高的溶剂,如DMF、DMSO、聚乙二醇等,用顶空进样测定的灵敏度不如直接进样,不适宜采用顶空法;顶空瓶的平衡时间一般应为30至60分钟,才能保证气液两相达到稳态平衡。
(2)供试品和对照品是否平行:由于供试品和对照品的液体部分状态不完全一致而造成的基质效应会直接影响到结果的准确性。采用标准加入法可以消除基质效应,但目前在国内的申报资料中较少见到,其原因可能是方法较为繁琐,且需要消耗大量的样品,对新药研发初期样品量较少的情况或一些贵重的药品不太适用。如果申报资料中提供了回收率数据,就容易判断基质效应的大小,但由于目前对此没有强制要求,大多数资料都未对回收率进行研究。因此在评价方法时,至少应要求对照品和供试品采用相同的溶剂溶解,且液体部分的体积应完全一致。
(3)重复性:由于顶空进样法存在气液平衡和气体进样的问题,粗放度较大,中国药典2005年版的要求是:内标法连续五次进样的相对标准偏差小于5%,外标法的相对标准偏差小于10%;欧洲药典则要求相对标准偏差小于15%,因此重复性应密切关注。 此外,无论是直接进样或顶空进样,都应尽量使供试液中的样品完全溶解,否则当残留溶剂被包裹在样品晶格中时就不能被检测出来,可能造成结果与实际情况完全不符。对溶解性差的样品,可采用不挥发性酸或碱的溶液、高沸点的有机溶剂、混合溶剂等来溶解样品,即使样品在加热的条件下可能被破坏,只要待测的残留溶剂不被破坏(如:测定酯类溶剂不能采用酸或碱溶液,以免发生分解)且样品的热分解产物不影响测定,那么方法也是可以认可的。如果确实有一些药物采用上述条件都不能达到溶解,则可考虑采用充分研磨或超声的方法破坏药物的结构,使其中的残留有机溶剂释放出来,当然,这种情况下一般应注意进行相应的方法学验证以确定方法的可行性。 在国外药典中,对残留溶剂检查的规定有所不同,其中以欧洲药典对残溶检查的要求最为严格,它建立了两个极性不同的色谱系统,对色谱系统的选择、色谱条件、溶液的配制方法、系统适用性试验、方法学验证等都作了详细的规定,以保证样品中所有的残留溶剂都能被逐一的、准确的检测出来,避免发生遗漏的情况;根据样品的具体情况选用其中一个系统测定后,还必须用另一系统加以验证,以保证结果的正确性。欧洲药典的残溶检查方法看似繁琐、呆板,但在其严谨、严格的框架下,结果的可信度、准确度、专属性、耐用性大大提高,值得我们研发者和评价者共同借鉴。 以上为个人在工作和学习过程中的一些体会,希望与大家一起讨论,共同提高。 [医学教育网整理发布]