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主题：【极限体验+第三届原创大赛】一次艰难的选择（12月）

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huaibeijiayuan

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发表于：2010/12/30 00:39:28 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

该帖子已被wangzijin设置为精华；

维权声明：本文为huaibeijiayuan原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

首先申明这是我的一个方法摸索过程，也许思路和想法有所欠缺，但只是代表我个人的理解和想法，最终的选择还要通过一段时间的优化才能真正进行一次完整的总结。

前一段时间单位因为有一个新品开发项目，作为我们检验部门也必须进行跟进，对这个产品的检验方法进行摸索因为涉及到公司一些相关秘密，产品名称暂不公布，就以A产品为代号吧，但是A产品对我们来说并不陌生，因为以前一直是我们采购的原料，而当时的检测方法就是用常规的化学滴定法进行测定，考虑到产品研制过程中的可变性和直观性，公司领导建议采用液相或气相色谱法进行检测。通过查阅相关的资料得知A产品的沸点比较高，达到280度以上，熔点也在150度以上，初步判断气相色谱不一定适合检测这个产品，因而重点查找有关液相色谱的方法。事实是事与愿违，各种资料显示产品介绍的比较多，大部分也是用化学分析法检测，相关液相色谱的资料少之又少，没办法只好自己摸索了。

液相色谱方法建立的关键是检测波长的确定，那么就首先进行波长的选择吧，先配制好一定浓度的样品在紫外下进行波长扫描，确定A产品的波长响应范围为240-260nm，在此波段波长下紫外吸收比较强，然后配制已知需要控制杂质的溶液同样进行波长扫描，得知B杂质的吸收波长在220-240nm，C杂质的吸收波长在240nm，因此初步确定方法的检测波长为240nm。

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2010/12/30 0:39:58 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

第二步选择色谱柱。手边有两个厂家的色谱柱，一个是安捷伦公司的，一个是月旭公司的。月旭公司的色谱柱我们也已经使用了有一年多的时间，从质量到售后表现都不错，还是先试试他们的色谱柱吧。这次用两根月旭的色谱柱进行了调试和比对，从分离效果看都还不错。正因为在相同条件下分离效果都不错，从而在最终选择哪根色谱柱花了很大的精力。
色谱柱的型号分别为①：AQ-C18；5um，4.6*250mm ②：XB-C18；3um，4.6*150mm
第三步溶剂的选择。A产品对有机溶剂的溶解性都比较大，但它其中的一个杂质对有机溶剂却有选择，在甲醇中很难溶，在乙腈中的溶解性要强于甲醇，因此有机溶剂选择了乙腈，另一个溶剂就是水了，样品偏酸性，因此增加0.1%磷酸或者三氟乙酸以矫正样品的峰型。
以下是详细的操作过程：
一、仪器及设备
液相色谱：agilent，HPLC1200；
检测器：VWD；
柱温箱：30℃；
色谱柱：月旭色谱柱：①AQ-C18；5um，4.6*250mm；②XB-C18；3um，4.6*150mm
电子天平：梅特勒BS-220；
二、试剂
乙腈（色谱纯）；
纯化水；
磷酸（色谱纯）
三氟乙酸（优级纯）

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2010/12/30 0:47:33 Last edit by huaibeijiayuan

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2010/12/30 0:41:45 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

三、过程
因为考虑到手边刚好有空闲的两个月旭色谱柱，为了节约时间和更好的开发方法，从而选择在相同条件下分别用两根色谱柱进行分离，在选择了流动相比例的同时可以基本确定其中的一根色谱柱。同时需要说明的是，这次调试是针对A产品进行探索的，对于杂质没有特意关注，后期只需进行杂质定性即可。
首先流动相选用的是：0.1%的磷酸/乙腈=50/50，在色谱柱平衡稳定后注射样品进行检测，下图是截取两个色谱柱分析后的谱图进行对照。从峰型上看两者不分上下，都比较尖锐，但细看感觉XB-C18稍微有点拖尾。从保留时间上看，XB比AQ更加理想，比较适中。

下图是二者的一些相关系数比较。分别用红线标注。

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2010/12/30 0:47:52 Last edit by huaibeijiayuan

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2010/12/30 0:43:14 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

其次是将流动相的比例调整为30/70，二者的保留时间分别有了很大的改动，特别是XB色谱柱，提前到了3.4min，这是我们所不愿看到的，AQ色谱就比较适中了。

同样有塔板数的比较。

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2010/12/30 0:48:15 Last edit by huaibeijiayuan

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2010/12/30 0:44:24 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

之后又进行流动相比例调整，但很可惜当时由于临时有事走开，也没有交接清楚，导致那部分谱图没有找到。同样后面的0.1%三氟乙酸调试也是委托他人帮忙进行的。

这是0.1%的三氟乙酸/乙腈=30/70，保留时间和峰型上没有太多的改观。

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2010/12/30 0:46:25 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

之后进行的是50/50的比例

这是40/60的比例

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2010/12/30 0:48:49 Last edit by huaibeijiayuan

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2010/12/30 0:46:40 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

从以上调试的情况看，两种色谱柱在合适的条件下都能达到很好的峰型和塔板数，但这二者只能选择其一，XB-C18在总体来看或多或少有点拖尾的感觉，不如AQ-C18的峰型漂亮，还有一个原因是因为XB-C18由于粒径比较小，仪器的泵压比较高，最高的达到了127bar的压力，而AQ-C18色谱柱的最高压力为100bar，因此在色谱柱选择上投了AQ-C18色谱柱一票。色谱柱选择后，对于流动相的选择就比较简单了，综合考虑后初步选择了40/60这个比例。

当然这是在样品纯度比较高的情况下进行的初步选择，也可能在日后的实际运行过程中会出现很多不合理的现象，这些都是需要在出现问题后才可以针对性的进行调整。经过这一个多月的试运行，也确实发现很多需要改进的地方，由于时间的限制，目前还在进一步的优化过程中，再经过一段时间的调整和优化，待方法成熟后会整理出一个详细的方法与大家共享。

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