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主题：【分享】大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

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发表于：2011/01/11 20:55:51 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

一可溶性蛋白的纯化
（一）菌体的破碎
1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机
2.方法
2.1反复冻融
2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。
2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。
2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)
2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。
2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

注意事项：
（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。
（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。
（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。
（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

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2011/1/11 20:56:55 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

二包涵体蛋白的纯化
1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了）
1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机
1.2 方法

(1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
（2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mM PBS 或20mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。
（3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml -10ml裂解液)
（4）每毫升悬液中加入100ul 10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。在冰上孵育15min
（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。
（6） 4℃，4000 rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。
注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.
2 包涵体的洗涤
(1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的Buffer A中，每克湿重加4-6ml洗涤液。
(2) 超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液10min。
(3) 4℃，4000 rpm/min离心15分钟。
(4) 重复上述操作2次至上清液透明无色。
(5) 将包涵体沉淀重悬于Buffer A，4℃，4000 rpm/min离心15分钟，弃掉上清。

BufferA 50mM Tris-HCl pH 8,
0.2mM EDTA,
100mM NaCl,
1% Triton x-100 （或2% 脱氧胆酸钠）
1mM DTT
1mM PMSF
溶菌酶 10mg/ml

注意事项：
(1) 包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。
(2) 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。
(3) 包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。
(4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级

沉淀法初纯包涵体，步骤如下：
(1) 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的Buffer A中，4℃涡旋悬液30min ，4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。
(2) 取一小部分上清用Buffer A稀释到盐酸胍浓度为4 M，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M，重复上面操作一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。
(3) 摸索好条件后，直接将剩余上清直接用Buffer A稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。

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