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液相色谱（LC）
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主题：【原创】HPLC的日常维护及常见故障排除

浏览0 回复12 电梯直达
蓝精灵
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发表于：2011/01/14 23:31:08 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
前些日子，应老师要求，在实验室做了一个有关液相日常使用注意事项和基本维护的报告，总结了一些自己几年来的液相使用经验，贴出来和大家分享一下，希望能对大家也有所帮助。纯属个人经验，如有不当之处，各位看官可以提出来交流，如有不当之处请轻些拍砖，谢谢……

一下是部分文字版，完整版在链接的PPT中



HPLC的基本结构
HPLC通常由储液器、（在线脱气装置）、高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处理系统等基本结构组成。
下面按仪器流路顺序依次介绍各部分的日常清洗及维护心得：

一，日常维护

1、储液器

Ø      流动相

①    过滤：微孔滤膜的选择：普通液相——0.45 mm、UPLC MS——0.22mm

②    脱气：脱气方式——过滤HPLC&MS；脱气，超声&在线

③    储存方法：现配现用、4℃保存一周

2、泵的维护

Ø      流速的升起与降低：渐续升渐续降

Ø      流动相是否充足：抽入空气干磨损伤泵

Ø      梯度洗脱在线脱气保持开启

3、六通阀的使用及清洗

Ø      推荐清洗方法：

在load与inject之间切换清洗

Ø      推荐使用方法

①    完全填充环：进样量为定量环体积的2~5倍

②    部分填充环：进样量不大于定量环体积的1/2

（注：阀切换速度过慢会对泵造成损伤，并影响进样量的准确度）

4、色谱柱的维护及清洗

Ø      柱接口的维护：不宜拧过紧

Ø      预柱的清洗

Ø      反相键合相色谱柱的清洗顺序：由样品和流动相组成决定（若流动相含盐或酸碱，须先用95%水，后用95%甲醇，各20倍柱体积）

5、检测器的维护

Ø      氘灯（寿命2000h左右）

①    不宜频繁开关

②    不使用时最好关闭

③    冲柱时可以不接检测器

二，常见故障排查

1、泵前流路气泡

Ø      原因：

①    滤头堵

②    流动相脱气不彻底

Ø      解决方法：

①    拆下滤头用纯水和甲醇各超声10min

②    将流动相摇匀后超声10min（1000ml）

③    打开旁路purge

2、物质保留时间重现性差

Ø      原因：

①    流动相比例不一致

②    梯度洗脱平衡时间不足

③    泵稳定性不好

Ø      解决方法：

①    由同一人配制并使用同一套量器

②    延长平衡时间

③    单向阀污染，清洗单向阀（不建议）

3、柱压不正常升高

Ø      原因：

①    管路堵

②    色谱柱堵

Ø      排查步骤：按流路顺序方向依次排查

Ø      分析原因：流动相中盐析出或是其他原因

Ø      解决方法：

①    用适当溶剂冲洗或超声清洗管路

②    用适当溶剂冲洗色谱柱

4、出不规则锯齿状峰，噪音异常变大

Ø      原因：

①    静电干扰

②    检测池污染

③    检测池有气泡

④    灯能量不足

Ø      解决方法：

①    接地

②    用适当溶剂低流速冲洗

③    排气（注意）

5、基线漂移

Ø      原因：

①    等度-柱平衡不足

②    梯度-某一相有紫外吸收、检测波长接近末端吸收

Ø      解决方法：

①    多平衡一段时间

②    向两相中加入等比例的盐或酸，尽量避免使用末端吸收

6、靠近死时间处经常出现负峰

Ø      原因：

①    样品溶剂吸光度低于流动相

②    洗脱出的物质在该波长无吸收

Ø      解决方法：

①    用流动相溶解样品

②    若不对测定造成干扰可以不予处理

7、液相峰分叉或肩峰

Ø      原因：（首先要确认是否两个物质未分开）

柱效降低，分离能力降低

Ø      解决方法：

①    冲洗柱子，用有机溶剂进行柱再生

②    倒用

③    废弃换新柱

8、峰展宽

Ø      原因：

①    流动相选择不合适（比例、种类）

②    柱效下降

Ø      解决方法：

①    查化合物理化性质，调节pH抑制解离

②    更换溶剂类型

③    更换色谱柱
附件：
HPLC日常使用及维护.rar
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有水有渝
xky0230699
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2011/1/15 11:04:48 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
阀切换速度过慢会对泵造成损伤，其原理是什么？
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阿三
junqiwudi
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2011/1/15 14:01:15 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
冲柱时可以不接检测器
是不是太麻烦了
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蓝精灵
xuxue_19861016
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2011/1/15 19:07:28 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
阀切换速度过慢会对泵造成损伤，其原理是什么？

呀，PPT中有个有关六通阀工作原理流程的flash忘贴出来了。原因在于阀切换的瞬间，阀内管线是密闭的，如果过程过慢会造成系统压力猛然上升，对泵造成损伤，且会造成进样的不平行，故建议快速切换。当然，上述都是对手动进样而言的。
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蓝精灵
xuxue_19861016
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2011/1/15 19:10:53 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 阿三(junqiwudi) 发表:
冲柱时可以不接检测器
是不是太麻烦了

在这个问题上有两个观点，一是连检测器，关闭灯冲洗，保护灯寿命且冲洗了流通池；二是，不连检测器，一定程度上可以减少进入池内的流动相，减少污染的概率。但是如果用过含缓冲盐的流动相，尤其是不挥发性缓冲眼，还是建议连检测器冲洗
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liuyanning
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2011/1/15 19:33:22 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主的太粗了，再细点就好了，谢谢楼主
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蓝精灵
xuxue_19861016
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2011/1/15 22:25:53 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 liuyanning(liuyanning) 发表:
楼主的太粗了，再细点就好了，谢谢楼主

呃，提供点改进意见呗，呵呵，比如感觉哪里粗？认为怎样细化能比较好？
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有水有渝
xky0230699
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2011/1/16 12:46:26 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 蓝精灵(xuxue_19861016) 发表:
原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
阀切换速度过慢会对泵造成损伤，其原理是什么？

呀，PPT中有个有关六通阀工作原理流程的flash忘贴出来了。原因在于阀切换的瞬间，阀内管线是密闭的，如果过程过慢会造成系统压力猛然上升，对泵造成损伤，且会造成进样的不平行，故建议快速切换。当然，上述都是对手动进样而言的。


这个我没有亲身实践，不过7725i号称不断流，不知道有没有楼主所说的这个现象
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liuliying-1987
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2011/1/16 17:42:27 12楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
阀切换速度过慢会对泵造成损伤，其原理是什么？[/有uote]
上下搬动进样阀是流路的瞬间是堵塞的，所以对泵有影响
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egeh
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2011/1/17 7:41:02 13楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
嗯嗯 对于我这种做研发的还是很有用的 先了解概况 再深究细节 谢谢楼主
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阿三
junqiwudi
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2011/1/17 14:59:08 14楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 蓝精灵(xuxue_19861016) 发表:
原文由 阿三(junqiwudi) 发表:
冲柱时可以不接检测器
是不是太麻烦了

在这个问题上有两个观点，一是连检测器，关闭灯冲洗，保护灯寿命且冲洗了流通池；二是，不连检测器，一定程度上可以减少进入池内的流动相，减少污染的概率。但是如果用过含缓冲盐的流动相，尤其是不挥发性缓冲眼，还是建议连检测器冲洗
恩 说的很有道理 我就是想知道现实应用中大家这么做的多不多 就像有人提议双泵的建议把流动相人为配好混匀超声然后只开一个泵 这样可以让一个泵休息 延长泵寿命 感觉很无语
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