2.核酸的碱基组成和分子杂交:
* 与形态及生理生化特性的比较不同,对DNA的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异,因此结果更加可信。
DNA-DNA 杂交
* DNA 杂交法的基本原理是用 DNA 解链的可逆性和碱基配对的专一性,将不同来源的 DNA在体外加热解链,并在合适的条件下,使互补的碱基重新配对结合成双链 DNA ,然后根据能生成双链的情况,检测杂合百分数。如果两条单链 DNA的碱基顺序全部相同,则它们能生成完整的双链,即杂合率为 100% 。如果两条单链 DNA的碱基序列只有部分相同,则它们能生成的“双链”仅含有局部单链,其杂合率小于 100% 。由此;杂合率越高,表示两个 DNA之间碱基序列的相似性越高,它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 %,而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的DNA 杂合率较低,约有 70 %。 G+Cmol %的测定和 DNA杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径,解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题,但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。
DNA — rRNA 杂交
* 目前研究 RNA 碱基序列的方法有两种。一是 DNA 与 rRNA 杂交,二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 与rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交一样,不同的是① 是 DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ,而 DNA 与 rRNA杂交中同位素标记的部分是 rRNA 。② DNA 杂交结果用同源性百分数表示,而 DNA 与 rRNA 杂交结果用 Tm(e) 和 RNA结合数表示。 Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需要的温度。 RNA 结合数是 100 m gDNA 所结合的rRNA 的 m g 数。根据这个参数可以作出 RNA 相似性图。在 rRNA相似性图上,关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不同的位置。用 rRNA 同性试验和 16SrRNA 寡核苷酸编目的相似性比较rRNA 顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念,并导致了古细菌的建立。
3.建立16 S r RNA系统发育树
* a)使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群;
* 传统的生物进化研究,主要基于复杂的形态学和化石记载,因此多限于研究后生生物(metazoa),而后者仅占整个生物进化历程的1/5
* b)提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法;
* c)对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据;
* d)突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制,建立了全新的微生物分类、鉴定理论;
* e)为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理论和研究方法,特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进行研究。