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主题：【分享】缓冲液流动相的配制

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发表于：2011/04/02 15:33:59 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

一、HPLC流动相溶剂选择的一般原则：

1. 溶剂要与使用的检测器匹配对UV－Vis，主要考虑本底吸收，下面是常用溶剂在不同波长下的吸收值： 200 205 210 215 220 230 240 250

乙腈 0.05 0.03 0.02 0.01 0.01 <0.01

甲醇 2.06 1.00 0.53 0.37 0.24 0.11 0.05 0.02

THF 2.44 2.57 2.31 1.80 1.54 0.94 0.42 0.21

醋酸1% 2.61 2.63 2.61 2.43 2.17 0.87 0.14 0.01

磷酸0.1% <0.01

三氟乙酸 1.20 0.78 0.54 0.34 0.20 0.06 <0.01

三乙胺1% 2.33 2.42 2.50 2.45 2.37 1.96 0.50 0.12

研究表明，当流动相的A>0.7的时候，基线噪声会显著增加，一般选择的吸收值<0.5。当A>1.0时，基本就不能用使了。对于示差折光检测器，主要考虑样品和流动相的折光率，这里不再赘述。

2. 选用的溶剂粘度要低、沸点适中使用低粘度溶剂，可减小容质的传质阻力，降低柱压，利于提高柱效。从分离制备和色质连用考虑，沸点要适中，低沸点的溶剂有它的优点；但仅仅用于分析，沸点太低，反而由于溶剂的挥发，造成保留时间的变化。

3. 尽量不用高毒性的溶剂不只是环境，单从我们自身的安全考虑，当然用低毒溶剂最好。

4. 溶剂对样品有足够的溶解力样品如果不能溶解在选用的溶剂里，还怎么分析？不屑多解释。但如果样品在流动相里溶剂仍然不大，可以用样品的最佳溶剂先溶解，再用流动相稀释，就可以了。

知道了上面选择溶剂的一般原则，就不难理解为什么不同乙醇、丙醇做流动相的原因了，因为它们的粘度大。

还有丙酮，虽然粘度和毒性较低、溶解度大、极性适中，但用于它的截至吸收波长为330nm，所以不常用，如果样品的吸收大于330nm，其实用丙酮是一个不错的选择。

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2011/4/2 15:34:43 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

二、缓冲液的配置（最佳方法）

缓冲液流动相可以根据下面的操作步骤配制：

1. 将缓冲液药品溶解在水中制成缓冲液（溶液A）。

2. 用pH计确定或调节溶液A的pH。

3. 将一定体积（如200ml）的有机溶剂B与由步骤2配制的溶液A（如800ml）混合，制成最终流动相（此处的有机相为20%）。

4. 检查最终流动相的pH（此处为选项）。

由于测定含有有机调节剂的流动相pH计发生漂移，使其测定pH不很可靠，所以上面的步骤4

一般只有在考察误差的主要来源时采用，大多数实验室皆略去此步骤。

步骤1一般是将配制缓冲液所用的两种试剂（A₁和A₂）分别按计算量先溶解在水中制成水溶

液，然后再将这两种溶液按一定的比例混合得到预期pH的溶液A。若在此步骤2中调节pH，则可以采用溶剂A滴定溶剂B，也可反过来滴定，并通过pH计测量得到所需pH的最终缓冲溶液。在大多数实验室中，pH的测量精度通常不会达到±0.05—0.1个pH单位，这会显著影响一些样品的分离。当HPLC方法对pH非常敏感时，步骤2只能大致确定pH值。

将准确称重的缓冲液配制试剂与精确体积的脱气蒸馏水混合，使其成为均一的溶液（不进一步调整pH），如此配得得缓冲溶液得pH可以控制在非常窄得范围内（±0.02单位），已知准确pH值得缓冲液浓溶液已有市售。

为了改善峰形或塔板数，有时在流动相中加入酸或碱（如三乙胺、乙酸等），如果这些添加剂并非为配制缓冲溶液时所采用得试剂，那么将这些试剂加入到流动相中后，还需重新滴加酸或碱，使流动相达到所需的pH值。

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2011/4/2 15:35:19 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

常用缓冲液的配制

当缓冲液被稀释或浓缩时，pH也应不变。其pH值应近似恒定不变，或当其中的离解的阳离子（K⁺、Na⁺）或阴离子（Cl^-、Br^-）被其它种类的离子替换时，表1—4中给出了响应的配制方法，平衡阳离子为Na⁺，缓冲液的最终浓度为0.1mol/l，对于其它浓度的缓冲溶液或阳离子种类（通常K⁺）更好，表中的数据也可供参考。较稀的或较浓的缓冲溶液，及包含有不同阳离子的溶液，其pH值会与表中的数据稍有出入。在方法建立过程中，精确的流动相pH值往往并不重要，重要的是每次新配制的流动相的pH值与第一次基本相同（最好控制在±0.02范围内）。注意，只有当缓冲溶液的pH在缓冲试剂解离常数pK^I_a±1范围内时，缓冲溶液才具有有效的缓冲容量（如乙酸盐的pK_a=4.6，其适宜的pH范围为3.6—5.6）。

表1 低pH值（25℃）磷酸盐缓冲溶液的配制方法

溶液A1：0.1M磷酸。配制精确pH值缓冲液时，所用磷酸需滴定H₃PO₄的含量。溶液A2：0.1M磷酸二氢钠溶液，称量13.8g NaH₂PO₄·H₂O溶解于水中，定容于1L容量瓶中。
pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）	pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）
2.0	565	435	2.8	175	825
2.2	455	545	3.0	110	890
2.4	345	655	3.2	55	945
2.6	250	750

表2 不同pH值（25℃）醋酸缓冲溶液的配制方法

溶液A1：0.1M醋酸溶液。6.0g（5.8ml）冰醋酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M醋酸钠溶液。8.2g C₂H₃O₂Na（或13.6g C₂H₃O₂Na·3H₂O）溶解于水中定容到1L容量瓶中。
pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）	pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）
3.6	926	74	4.8	400	600
3.8	880	120	5.0	296	704
4.0	820	180	5.2	210	790
4.2	736	264	5.4	176	824
4.4	610	390	5.6	96	904
4.6	510	490

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2011/4/2 15:36:31 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

表3 不同pH值（25℃）柠檬酸缓冲溶液的配制方法

溶液A1：0.1M柠檬酸溶液。21.0g 柠檬酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M柠檬酸钠溶液。29.4g C₆H₅O₇Na₃·2H₂O溶解于水中，定容到1L容量瓶中。
pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）	pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）
3.0	930	70	5.2	360	660
3.2	870	126	5.4	320	680
3.4	810	190	5.6	270	726
3.6	750	260	5.8	230	764
3.8	700	300	6.0	190	810
4.0	660	340	6.2	140	856
4.2	610	370	6.4	60	940
4.4	560	440	6.6	40	960
4.6	510	490	6.8	30	970
4.8	460	540	7.0	10	985
5.0	410	590

表4 中等pH值（25℃）磷酸缓冲液的配制方法

溶液A1：0.1M磷酸二氢钠溶液。13.8g NaH₂PO₄·H₂O溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M磷酸氢二钠溶液。26.8g Na₂HPO₄·7H₂O（或35.9g Na₂HPO₄·12H₂O）溶于水中，定容到1L容量瓶中。
pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）	pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）
5.6	948	52	7.0	390	610
5.8	920	80	7.2	280	720
6.0	877	123	7.4	190	810
6.2	815	185	7.6	130	870
6.4	735	265	7.8	85	915
6.6	685	315	8.0	53	947
6.8	510	490

表5和6给出了适于pH=7—10.6范围的两种有机碱缓冲液配制方法，这种有机碱缓冲液可以有效低减缓硅胶基柱的柱效降低。

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2011/4/2 15:37:27 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

表5 高pH（25℃）甘氨酸缓冲溶液的配制方法

溶液A1：0.2M甘氨酸。15.01g 甘氨酸溶于水中，定容于1L容量瓶中。溶液A2：0.1M NaOH溶液，稀释较浓的NaOH溶液。
pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）	pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）
8.6	25	2.0	9.6	25	11.2
8.8	25	3.0	9.8	25	13.6
9.0	25	4.4	10.0	25	16.0
9.2	25	6.0	10.4	25	19.3
9.4	25	8.4	10.6	25	22.75

表6 高pH值（25℃）Tris缓冲溶液的配制方法

溶液A1：0.1M Tris（无碱），12.11g Tris溶于水中，定容到1L容量瓶中。

溶液A2：0.1M HCl溶液，稀释较浓HCl溶液。

表5 高pH（25℃）甘氨酸缓冲溶液的配制方法

溶液A1：0.2M甘氨酸。15.01g 甘氨酸溶于水中，定容于1L容量瓶中。溶液A2：0.1M NaOH溶液，稀释较浓的NaOH溶液。
pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）	pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）
8.6	25	2.0	9.6	25	11.2
8.8	25	3.0	9.8	25	13.6
9.0	25	4.4	10.0	25	16.0
9.2	25	6.0	10.4	25	19.3
9.4	25	8.4	10.6	25	22.75

表6 高pH值（25℃）Tris缓冲溶液的配制方法

溶液A1：0.1M Tris（无碱），12.11g Tris溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M HCl溶液，稀释较浓HCl溶液。
pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）	pH	A1体积（ml）	A2体积（ml）
7.1	50	45.7	8.1	50	26.2
7.2	50	44.7	8.2	50	22.9
7.3	50	43.4	8.3	50	19.9
7.4	50	42.0	8.4	50	17.2
7.5	50	40.3	8.5	50	14.7
7.6	50	38.5	8.6	50	12.4
7.7	50	36.5	8.7	50	10.3
7.8	50	34.5	8.8	50	8.5
7.9	50	32.0	8.9	50	7.0
8.0	50	29.2