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主题：【分享】噬菌体检查及效价测定

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发表于：2011/06/01 11:24:54 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原理
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑——噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速检查、分离并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。

检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。

采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以便采取必要的防范措施。根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮，可以进行噬菌体检查。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。

噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。

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2011/6/1 11:26:10 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3.1 菌种

敏感指示菌（大肠直菌）、大肠杆菌噬菌体（从阴沟或粪池污水中分离）。

3.2 培养基

二倍肉膏蛋白胨培养液、上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管5mL）、下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%）、1%蛋白胨水培养基。

3.3 仪器和器具

无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管（1mL、5mL），恒温水浴锅，离心机、721分光光度计等。

噬菌体的检查5.1.1 样品采集将2~3g土样或5mL水样（职阴沟污水）放入灭菌三角瓶中，加入对数生长期的敏感指示菌（大肠杆菌）菌液3~5mL，再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。5.1.2 增殖培养30℃振荡培养12~18h，使噬菌体增殖。5.1.3 离心分离将上述培养液以3000r/min离心15~20min，取上清液，和pH值7.0，1%蛋白胨水稀释至10^-2~10^-3，用于噬菌体检查及效价测定。5.1.4 生物测定法（1）双层琼脂平板法①倒下层琼脂：融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。②倒上层琼脂：融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌（大肠杆菌）菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2~0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。③恒温培养：30℃恒温培养6~12h观察结果。④观察结果：如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑——噬菌斑。（2）单层琼脂平板法省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板，30℃恒温培养6~16h后观察结果。5.1.5 离心分离加热法（快速检查）取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液，4000r/min离心20min，分别取两组发酵液的上清液（A₁），一部分于721分光光度计上测定OD₆₅₀光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A₂），检测A₂溶液OD₆₅₀光密度值，记录结果。

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噬菌体效价的测定
5.2.1 倒平板

将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。

5.2.2 稀释噬菌体

按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL 1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10^-1，依次稀释到10^-6稀释度。

5.3 噬菌体与菌液混合

将11支灭菌空试管分别标记10^-4，10^-5，10^-6和对照。分别从10^-4，10^-5和10^-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做3个管，在另外2支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细菌。

5.4 接种上层平板

将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速摇匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平殖置，凝固后置37℃培养。

5.5 观察并计数

观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30~300个噬菌斑的平板计算呼菌体效价。计算公式：

N=Y/V·X

式中：N为效价值；Y为平均噬菌斑数/皿；V为取样量；X为稀释度。

例如：当稀释度为10^-6时，取样量为0.1mL/皿，同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：N=186/0.1×10^-6=1.86×10⁶。

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2011/6/1 11:27:06 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

结果
6.1 噬菌体检查

（1）离心分离加热法

处理方法	OD650光密度值
	正常发酵液（对照）	异常发酵液（试验）
离心上清液（A₁）
离心上清液加热煮沸后（A₂）
A₂/A₁