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主题：【分享】细胞培养中常见的污染情况总结

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发表于：2011/06/20 19:30:43 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免 的
 
1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！

 2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。

3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。

5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。
6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。
7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。


1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！
可在培养液中加相应的抗生素处理
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2011/6/20 19:31:30 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，
用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作
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2011/6/20 19:34:46 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。

4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。
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2011/6/20 19:37:05 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

污染的可能原因：可能原因很多。比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等
关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。
也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。

1、孵箱应定期用三氧机消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水
2、超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素
3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染
4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。
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2011/6/20 19:38:53 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1关于黑胶虫的描述
1.1分类上的描述
对于黑胶虫的分类，学术界没有明确给予说法。关于黑胶虫的分类，目前大部分人认为黑胶虫污染是微生物感染。在一些文章论述上把黑胶虫归为生物污染类型，但是没把它归为确定的生物分类类型，只是把黑胶虫独立为一种未知生物。而根据中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，但是由于课题经费不够而不能继续下去，最终也没有有力证明黑胶虫是属于原虫。也有一些学者不认为所谓的黑胶虫污染是一种生物污染，而认为是细胞碎片类物质，是在细胞培养时，细胞衰亡破裂产生的；也有在文献中报道说是玻璃瓶中类似氧化硅的物质，那个文献很少人找得到；还有报道黒胶虫是一种纳米级的细菌。

1.2形态上的描述
形态上类似与杆状细菌，但长度比细菌长，直径约在0.5~1微米，不染色观察为黑色；胶虫成熟后呈线状，而且形态是椭圆形。

1.3运动形式
在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动），即很多细胞培养者看到的，像黑色的小虫游来游去。可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去。但是在物理学上来说，颗粒足够小，在液体中也是做布朗运动的，这不足以说明黑胶虫的布朗运动就证明它是生物。

1.4生理上的描述
1.4.1抗性
抗细菌和抗霉菌的药物对黑胶虫均无效，可以保守的判定黑胶虫不属于细菌。
1.4.2环境抗逆性
将培养器材150度烘烤8小时，可以消除，这个黑胶虫高压灭菌泡酸都不死。可见黑胶虫可以耐高温高压，而且还有点嗜酸，如果证实它是生物的话，那它很有可能是极端微生物，一种古菌。
1.4.3营养条件
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。可见“黑胶虫”是一种异养生物。
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2011/6/20 19:40:33 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
2对黑胶虫的各种猜测及相应的处理
2.1非生物类
2.1.1细胞碎片类
在细胞培养的时候，由于细胞代谢、物质交换、周边环境变化，尤其是在从37度培养箱中拿出来观察的过程中，由于液体培养基的比热较大，液内温度高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，当然这些小岁末就会被搅动起来形成似乎“游动”的感觉；随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂，破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和残渣的出现；再者，“黑焦虫”问题是很多细胞培养者已经发现的问题，但到目前为止尚未找到其监测和排除的试剂和手段，这首先是由于所谓“黑焦虫”病原体根本难以收集和捕捉，这也从另一个侧面证明了“黑焦虫”问题的难以确定性；再说任何一种外来的微生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单地运动那样的外观性表现。举一个例子：如果“黑焦虫”的运动状况已经到了用显微镜已经可以观察出的程度，其营养代谢和能量需求也就可想而知。这样，培养液中的影响消耗、酸碱含量程度等都要发生明显变化。比如说：迅速的、大含量的沉淀，pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡、引发其它类型微生物侵染等等。而这些状况，在所谓的“黑焦虫”感染中，是很难观察到的。同时“黑焦虫”的出现而影响细胞状态似乎得不到有力的证据。倒是细胞状态下降的时候，“黑焦虫”明显增多了。很有可能是细胞状态下降时，细胞衰亡产生的细胞碎片。所以黑胶虫属于细胞碎片是比较可能和合理的。
2.1.2玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西
网上有一篇文章说，黑胶虫其实不是一种生物，是无机物，其本质是玻璃培养瓶里的硅颗粒。可影响细胞生长，细胞状态好时，不明显。细胞状态较差，数量少时才容易看到，最好的办法是用一次性培养瓶，可消除黑胶虫影响。
2.1.3血清聚合物产物
gibco公司的血清说明，此物为血清聚合产物，而不是微生物
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2011/6/20 19:41:26 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
2.2生物类
2.2.1支原体
有人曾认为黑胶可能是支原体污染，因为相对比较权威的网站文章指出，黑胶虫可以通过滤膜，可以在空气中传播。而恰巧口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，所以实验室之操作人员的污染亦可能为支原体的污染源。但有人为此做了实验证明黑胶虫不会是支原体，原因如下：
1、光镜下可见, 因为体积不对，支原体在普通显微镜下不能看到。
2、多种染色后可见，甚至hoechst即能将它染色,一般来说支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。所以，黑胶虫是一种支原体的可能性比较小。
2.2.2真菌
有很多人发现类似黑胶虫的，但最后确定是真菌，二性霉素B对其有效。那说明黑胶虫不存在只是细胞培养中的真菌感染，还是说明黑胶虫污染属于真菌类污染物。如果黑胶虫是一种真菌，那么由此引起的污染是不会引起那么多人的关注，即使它很特殊。但是这不能排除那些认为“黑胶虫”是真菌的细胞者，看到的只是一般真菌感染。由于细胞被感染了，要进行拯救处理，不像理论上那么简单，稍有不注意都是很容易导致培养失败，所以黑胶虫是一种真菌也是不太可能。
2.2.3寄生类原虫
黑胶虫属于寄生类的原虫，而不是细菌、支原体，也不是什么补体、细胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到胶虫有两种不同形态，一种较大，运动较慢，泛红光；另一种较小，运动较快，红中带绿，个小的围着个大的分布，很可能是公的围着雌的。这种生物也并非离开细胞就不能存活，也有人做过这样的试验，单纯培养过污染胶虫的血清4周，直到满视野都是黑煤渣般的胶虫。给人的感觉是胶虫和细胞一样有丛集性，如果胶虫密度低则生长缓慢，如果手懒，拖了几天没换液，待胶虫生长到一定浓度后便会飞速分生，细胞受感染的程度也大，这时除了培养基中可见外，细胞表面通常也象长满了粉刺，所以有人认为细胞旁分泌的某些因子可以抑制胶虫的生长。据说，中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。由此黑胶虫属于原虫的有比较大的可能性。
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2011/6/20 19:42:20 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
关于再细胞培养中出现黑胶虫后的几种处理建议
1．换好一点的血清，当然最好是进口胎牛血清（国产血清太脏），就是价格高的离谱，经济条件不允许，可以用进口新生牛血清代替。建议如果使用的是Hyclone或GIBCO的血清可不必灭活，这样可以有效减少“小黑点”的形成。一般的血清都不要去灭活处理，为什么呢？INVITROGEN公司在其血清说明书上解析道：经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热灭活的血清，沉淀物的形成会显著增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。除非是在做免疫学研究或培养干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，才推荐做热灭活。所以在不是做免疫学研究或培养干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞培养时，血清尽量不经热灭活。

2．如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。如果细胞不是非常珍贵，可以用伯氨奎、磺胺、四环素、贝尼尔，也有建议庆大霉素500ug/ml洗涤。
3．换用进口的一次性塑料培养瓶。
4．停止复苏，停止养细胞，彻底消毒所有用于细胞培养的一切用品，包括所用的培养瓶，培养基，吸管，胰酶，孵箱，超净台、空间等等你能想到的和细胞培养相关的所有物品。一个星期后，再复苏污染之前冻存的细胞，注意你的白大衣衣袖污染即可。这样你可能觉得动作太大，但可以用一个星期的时间挽救两个月的时间，还有其他你为了找到污染源，去除污染所耗费的精力，和财力。
5．在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。
所有东西最好重配；如果实在要抢救，重点突破，留几瓶污染不是很严重的细胞抢救，其余弃去
6．如果有其它可用的细胞，那么污染的细胞最好扔掉；如没有，可试着用抗生素，最可靠的是细菌培养加药敏，据药敏结果选择抗生素，当然不能影响到细胞的状态。
7．有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。
由于黑胶虫尚未明确鉴定出是什么生物，所以上述的处理方法不一定正确，可以供考虑采用。
8.有人为寻找到杀灭“黑胶虫”的方法，做了一个试验，他取有“黑胶虫”污染的六孔板，每孔内有2ml培养液，向有污染的孔内分别加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新洁尔灭原液，边加边在倒置显微镜下观察。最后他得出结论：新洁尔灭与水或培养基的比例为1：4时即可杀死“黑胶虫”。但是新洁尔灭对细胞的负面影响太大，比较珍贵的细胞培养最好不采用此方法。
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2011/6/20 19:42:59 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
从前面关于黒胶虫的描述可以看出，人们遇到的黒胶虫并不都是一样的，有象细菌的、有象支原体的、有象原虫的、有象真菌的，还有象细胞碎片的。在国内个实验室的器材条件参差不齐，而且实验人员的操作质量也不尽相同，同一种现象也可能有些许差异，当用描述出来的现象的差异可能变大也可能变小。所以很多人看到细胞被细菌污染了，不好处理，而却描述出来的现象和流传的黑胶虫类似，就会把培养失败的原因归结到无法处理的黒胶虫污染，甚至可能说它发现的是真正的黑胶虫。这样的事情多了，黑胶虫就会人为的变种，象什么的都有。黑胶虫是否存在，还有待于科学的发展。但有一点可以肯定的，大部分人发现的“黒胶虫”并不是真正那个未知的黒胶虫，而是不很常见的细菌、真菌、原虫等微生物污染。
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2011/6/20 19:49:51 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一、细菌污染

  细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。

  培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，ph改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。

  二、真菌污染

  真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
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2011/6/20 19:53:37 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
三、支原体污染

支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件(ph7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。

  培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。

  四、病毒污染

采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有sv40或多发瘤病毒，b淋巴细胞含eb病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

  五、非同种细胞污染

由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物，erk/kd细胞是从兔肾中分离出来的，而现在句却认为是hela细胞。目前，世界上已有几十种细胞都被hela细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

  非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。　
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