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主题：【分享】化学分析样品制备（续之前的86讲）

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2011/7/19 15:35:57 21楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（81）

2.4.4  操作方法

多阶段SPE（2）

用多阶段SPE分离净化毒莠定和4-D后测定它们在水中的含量

      Wells等人使用多阶段SPE程序，即用不同的洗脱剂从反相SPE小柱上分别净化和洗脱毒莠定和2,4-D。

SPE固相萃取的设备：C18一次性SPE柱，溶剂回收装置，适配连接器和真空箱（J.T. Baker Chemical 公司）。

标准样品：分别溶解毒莠定和4-D于水中，并把此储备溶液分别制备成一定浓度的稀释样品溶液。

样品处理：把水样用浓硫酸酸化到pH 2，把两支Baker C18 小柱用适配连接器前后串连在一起，每支小柱装有500 mg 吸着剂，并连接到一个75mL容量的聚丙烯样品回收容器上，并在溶剂瓶底部放一个1.0625英寸直径的聚乙烯过滤片，把此装置安装在有支管的吸滤瓶上，把5mL ACN注入到SPE小柱中，然后再注入10mL 4% 的乙酸水溶液，进行真空抽滤。真空度为 530mm Hg柱，流速保持在10～12mL/min，在SPE小柱干以前注入样品，然后用2 mL 4% 的乙酸水溶液冲洗。把溶剂瓶底部的过滤片拿掉，用 9mL 25% 的乙酸水溶液直接把毒莠定洗脱到10mL 容量瓶中（放在真空箱中），往容量瓶中加0.5mL 饱和高锰酸钾溶液，在室温下放置5min，一滴一滴加如5mol 亚硫酸氢钠，使高锰酸钾褪色，用25% 的乙酸水溶液把处理好的溶液稀释到 10mL.

  2，4-D仍留在SPE柱中，用4.5 mL甲醇把它洗脱到5-mL容量瓶（放在真空箱中）中，再用甲醇稀释到5.0 mL用于分析。

    上述两份样品溶液个取50 uL 进样到液相色谱仪进行分析。

文献

[1] M. J. M. Wells，J. L. Michael,Anal.Chem.,1987,59(13):1739～1742
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2011/7/19 15:38:48 22楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（82）

2.4.4  操作方法

SPE 的自动化（1）

      在过去20年SPE操作的自动化使用96-孔SPE操作台大大提高了效率，而且萃取盘也有商品供应了，一次可以处理大量样品。SPE操作的自动化的优点是：

1.  高通量（没小时25 到 50个样品），如使用平行操作还可以更多（每小时高达400个样品）；

2.  提高精密度和准确度,是分析人员免受有害样品的影响；\

SPE操作的自动化的却点是：

1.  有潜在携留的危险；

2.  产生系统误差降低精密度和准确度；

3.    影响样品的稳定性。

      在上世纪80年代末SPE操作的自动化的文献很少，但是到90年代末各个领域就有很多使用SPE自动化操作的文献，如在环境科学、食品科学、药物、生物分析、法庭科学、生物化学、和有机合成方面都有很多应用。图 112-1

   


文献：D. T. Rossi , Nanyan Zhang，J. Chromatogr.A, 2000,885:97–113
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（84）

2.4.4  操作方法

SPE 的自动化（3）

SPE 自动化系统的设备

      SPE 自动化系统有三种类型：1. 在线SPE 自动化系统。2. 不连续的SPE柱工作站。 3, 96孔SPE工作站。

1. 在线SPE 自动化系统

      在生物样品分析中有三种在线SPE 自动化系统：一个是利用限进性填料柱直接进样进行在线分析；第二种方法是使用湍流色谱进行快速分析；第三种是使用在线固相萃取进行分析。

      限进性填料柱的概念是把硅胶制做成亲水性外表面和疏水性内表面控制在一定尺寸的分离介质，如图所示：



图 114-1 限进性填料示意图

      大的生物分子如蛋白质被阻止在外面，不能进入分离介质孔中，而药物和其他小分子可以进入分离介质，他们在分离柱的填料里进行分配保留，这一方法是把排阻色谱和分配色谱结合在一起，可获得一定的色谱分离效率，这一方法常常需要利用色谱柱或溶剂切换进行分析，有时也需要使用反吹设备，这一方法有时需要几天的时间来确定适合的条件，样品体检限制在10–50 ml。限进性填料柱在进行样品处理以后，当样品进入下游的分离柱之后，需要用1.1 到 2 ml溶剂进行冲洗。这一方法的缺点是前次进样与下次进样的间隔时间比较长(8到15min),要有多个样品等待分析时会出现样品（分析物和基体）稳定性问题，样品的携留问题也会有。
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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（85）

2.4.4  操作方法

SPE 的自动化（4）

湍流色谱在样品快速处理中的应用

      湍流色谱是一种直接进样的方法，要使用一种特殊的色谱柱，多用于血浆和血清的分析，所用色谱柱装填大颗粒（50μm）填料，其内孔为20μm，流速达到5 到 10 ml/min，这样一来形成涡流而不是层流，从而达到快速平衡，使分析物在填料内孔中扩散，这样一来可以使大分子物质和小分子被分析物分离开来，样品制备只需要简单地像进行一次离心分离一样。色谱柱还可以反冲洗以避免系统留存不溶解的物质。方法的灵敏度相当于脱机分析（50mL样品每毫升亚纳克）。如果色谱峰有前伸或拖尾时柱效会有较大损失，见图115-1。对多种化合物的携留量为在0.15 到 0.5%之间，似乎在这一方法的有效动态范围内[1]。



图115-1  湍流色谱色谱峰有前伸或拖尾

    最近南京中国药科大学李萍教授的研究组就利用湍流色谱进行样品处理，和用快速HPLC分析中药贝母碱（verticine）类化合物[2]（见下面的结构式）。


文献：

[1] D. T. Rossi , Nanyan Zhang，J. Chromatogr.A, 2000,885:97–113

[2] Gui-Zhong Xin1, Jian-Liang Zhou1, Lian-Wen Qi, Chang-Yin Li, Peng Liu, Hui-Jun Li,Xiao-dongWen∗∗, Ping Li，J.Chromatogr.B,2010,878:435-441

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2011/7/19 15:56:59 25楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（86）

2.4.4  操作方法

SPE 的自动化（5）

利用湍流色谱进行样品处理的装置

      李萍教授的研究组[1]使用湍流色谱-液相色谱/质谱（TFC-LC/MS）分析中药贝母碱（verticine）类化合物，所使用的装置如图116-1 所示。

图 116-1 A 是岛津Shimadzu 10A 泵（日本岛津公司）用于输送高流速液流通过一个疏水-亲水平衡（HLB）固相萃取柱（(OasisHLB, 25[1]m, 2.1mm×20mm;Waters公司, 美国)，用以加载或洗涤样品，然后冲洗并平衡萃取柱，水通过这一高压泵用作溶剂A。使用Agilent 1100 HPLC 系统（二元泵，带有在线脱气，自动进样器和恒温控制柱箱），进行梯度洗脱完成样品的分离（使用Agilent Zorbax 稳定键合 C18 色谱柱，4.6mm×50mm, 1.8μm)。10mmol 甲酸铵水溶液（含0.1%甲酸）为溶剂B和乙腈（溶剂C）做流动相。用两个Rheodyne六通阀进行柱切换。六通阀图标上的L用于加载样品，E 是指进行洗脱流路。

TFC-LC/MS分析的运行

    取整分数样品100μL大鼠血浆，（空白血浆，校准用标样，质量控制样品，药动学研究样品）与100μL 2%甲酸溶液混合，和200 μL puqienine A（内标）67.0 ng/mL的甲醇溶液，把混合物斡旋30 s，在13,000 rpm离心机上在 4℃下离心10min，取50 μL上层清液进样进行TFC-LC/MS分析。进样后把切换阀放到L的位置，Shimadzu 10A 泵开始以4.0mL/min流速输送溶剂A，把样品送到HLB萃取柱中，然后再清洗样品，血清样品中的蛋白质和盐在萃取柱中被除去（见图116-A），加样和洗涤样品在1min之内完成，之后把切换阀扳到E的位置（见图116-B），把萃取柱切换到HP 1100泵的位置，HP 1100泵开始使用溶剂B和溶剂C进行梯度洗脱(0–6min, 28–30% C; 6–8min, 30–100% C)，以0.5mL/min的流速从萃取柱中洗脱被分析物到RRHT柱，这一过程持续7min，然后再切换到L位置。用4.0mL/min流速平衡HLB柱，为下一个分析作准备。

文献

[1]  Gui-Zhong Xin, Jian-Liang Zhou, Lian-Wen Q, Chang-Yin Li, Peng Liu, Hui-Jun Li,Xiao-dongWen, Ping Li，J.Chromatogr.B,2010,878:435-441

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第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（87）

2.4.4  操作方法

SPE 的自动化（6）

全自动-SPE-色谱分析

    广泛使用的自动SPE装置是Prospekt系统，这一装置把定制的SPE柱通过电驱动的切换阀与HPLC系统结合在一起，可以事先把很多SPE小柱安置在这一系统里，在程序的运行下以96-孔SPE模式进行处理和分析。




这一系统包括三个部件：左边——装有一个2 mL定量进样管的恒温自动进样器。

    中间——在线SPE萃取系统，带有一个六通阀溶剂输送单元（SDU）和一个Prospekt阀换系统。右边——带有四元泵和可变波长检测器的HPLC系统，并有数据处理系统。

全自动SPE-色谱分析程序

取0.7 ml血浆样品，加入0.4 ml溶于工作溶液中的内标物，把这一混合物进行涡旋，并转移到2-mL 的进样瓶中，放到自动进样器的瓶架上（恒温48℃），准备进样分析。按照表117-1的程序取样0.8 mL进行分析。



文献

[1]  D. T. Rossi , Nanyan Zhang，J. Chromatogr.A, 2000,885:97–113

[2]  ´ J.A. Pascual, J. Sanagustın / J. Chromatogr. B， 1999，724：295 –302
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