主题：【第六届原创】多肽检测方法的建立

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xizhi

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发表于：2011/07/26 11:46:06 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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随着国际上肽类药物的不断被开发，多肽的液相检测开始很受关注。
在开始做多肽分析之前要首先了解多肽的构成——氨基酸的性质，两个酸性（Asp、Glu），三个碱性（Arg、His、Lys），以及他们的亲疏水，特别是Val、Ile、Leu三者基团多的肽链要格外注意，以下列出二十种氨基酸疏水比例：Arg（R）-4.5 、Lys（K）-3.9、Asn（N）-3.5 、Asp（D）-3.5 、Gln（Q）-3.5、Glu（E）-3.5、His（H）-3.2、Pro（P）-1.6、Tyr（Y）-1.3、Trp（W）-0.9 、Ser（S）-0.8 、Thr（T）-0.7 、Gly（G）-0.4、 Ala（A）1.8 、Met（M）1.9 、Cys（C）2.5、 Phe（F）2.8 、Leu（L）3.8 、Val（V）4.2、 Ile（I）4.5。

肽链构成的不同直接决定检测方法的建立，根据肽链我们再决定该肽的溶解方法以及检测时所走的梯度。

首先谈液相检测样品的溶解，现在取样量用2mL透明进样瓶作参照，一次取样量碾成粉末后基本上薄薄的铺满瓶底1/3。对于一条肽链来说能否顺利纯化就看关键能不能将它很好的溶解。溶解的原则就是尽量用最少的有机试剂达到最优的溶解效果，这个不是为了节省有机试剂，而是确保样品不会因为有机试剂加多而提前出峰，进而影响判断。

对于一条普通的肽加水和乙腈就可以溶解了，样品溶解先碾成粉末，一般疏水基团数目不超过40%比例的但多于10%的，考虑在样品碾成粉末后先加两滴乙腈，稍微摇晃使样品在乙腈中分散均匀，再一滴一滴加高纯水，先加一滴如果发现水滴下去的位置样品能溶掉可再滴加直至0.5-0.7mL（适当体积）左右，滴加水过程中观察样品有没有析出，如果有就立即停止加水，补滴乙腈，再通过不断调整水与乙腈的比例再将样品体积控制在0.5-0.7mL左右，注意尽量用最少的有机试剂达到最优的溶解效果。体积控制好后观察样品中有没有没能溶解的颗粒或者絮状物，如果有就用超声，仍不能溶解则考虑过滤掉非溶物，样品即可用了。如果当时加完乙腈再滴加水时发现这样并不能让该肽溶解，则再多加乙腈试试，如果可溶就此放大体积至0.5-0.7mL，后面处理同上。若多加乙腈不溶这时就要比对肽链序列的酸碱性，一般碱性很好溶，难溶的多属酸性，如果酸性不强考虑用醋酸铵，如果不行就用稀释至10%的氨水，用碱性助溶试剂时一定要注意该肽链里有没有Cys基团，如果有尽量少用，可以考虑先用纯甲酸溶再用乙腈和水稀释至适当体积，如果纯甲酸不能溶那只好加碱性试剂，不过接下来检测要快，不能让样品不必要的时间滞留，避免样品变质。如果乙腈与水不能溶解，而且该肽不显酸碱性，则考虑加甲酸溶，如果这样不行则用纯甲酸先不加乙腈和水，能溶掉考虑再稀释，溶剂成份加的顺序是有讲究的，不能溶可以考虑用稀氨水，以上都不行的话就考虑放弃，如果非要检测结果的可用DMSO试试助溶。如果一开始疏水基团就大于40%就多加乙腈，谨慎加水，必要时甲酸、氨水；疏水基团少于10%的直接考虑水溶不加有机相。

样品溶解好就要做液相及质谱检测。检测时要分析清楚序列特点，含Trp的样品测前加少许酸（TFA、乙酸，0.1%-1%），再用吹风机对吹2-5min，瓶身发烫为止，Trp会结合不稳定的羧基，含不含该羧基的会各自形成一个峰，所以务必要处理；含至少两个连续的Pro，多个连续Ser的要把柱温箱加热到50度再测，这样的基团在常温下检测会形成假的肩峰，加热可避免；对于整条肽链都是两三个基团重复构成的有可能在C18柱上出峰很小，这时可以考虑用CN柱；对于那些用碱性溶剂溶解的样品尽量用CN柱在4g/L的醋酸铵流动相里测。至于检测时梯度的设定很大程度受经验的影响，不过做久了会发现其中的规律，拿250mm、5um的C18柱举例，A：0.1%(V/V)TFA in H2O，B：0.1%TFA in 80%(V/V)ACN，以下涉及流动相比例未强调的均是体积比。十个氨基酸左右长度的肽，亲疏水总和接近0时就用10-70%B in 20min，如果亲水的总值是疏水总值的两倍，酌情考虑用0-60%B或者5-65%B；如果亲水的总值是疏水总值的1/2，考虑用20-80%B,据此演推。如果氨基酸链长达到二十多个，前面三种情况就要分别改为梯度20-80、10-70、30-90，不过很多时候要注意里面对亲疏水性影响很大的几种氨基酸的比例，如三种碱性两种酸性和酰胺以及亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸，往往对溶解产生直接影响的是这些氨基酸。所以这些氨基酸的比例要格外留意。一般出峰时间控制在7-15分钟认为有分离效果。
一个合适检测条件直接关系到接下来多肽纯化条件的设定以及该肽特性的判断。