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| 题目：Recombinant Environmental Libraries Provide Access to Microbial Diversity for Drug Discovery from Natural Products 类别：环境微生物／药物开发 出处：APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Jan. 2003, p. 49–55 主要观点、创新点及学术、技术意义（以下从目的why、方法how、结果what、讨论总结so四方面加以解析）： Why？ 为更进一步探究天然产物药物来源的微生物生物多样性，文章探索了可能的途径。 How？ 1．文章构建并且筛选了一个包含5，000个克隆的"鸟枪"环境基因组文库， 文库使用大肠杆菌－链霉菌粘粒穿梭载体作为媒介，插入片断直接来源于环境未经培养的微生物。进一步通过遗传信息(GC%，rRNA)途径评估了文库的多样性。 2．为进一步将环境文库系统发生多样性分析和评估其包含相关功能基因的潜能联系起来，文章以聚酮（由各种土壤微生物产生的结构多样的天然化合物家族）生物合成基因簇的酮基合成酶为目标，利用活性位点附近高度保守的两套放线菌来源的已知引物对文库进行了96孔池的扩增和序列分析。 3．为探究土壤粘粒文库中异源DNA表达情况，文章对文库进行了各种生物学活性克隆筛选。将大肠宿主中的文库克隆排列在琼脂平板上，30度生长几天后，覆上一层B. subtilis来检测抗细菌活性。此外，为检测编码卡那抗性的基因，该基因可能位于生物合成基因出的邻近，克隆涂于含卡那的培养基上。 4．液相筛选文库克隆抽提物中的异源分子：为进一步考察土壤粘粒文库中异源DNA的表达情况, 文章利用液相化学筛选手段, 检测和定性文库克隆中新代谢物。除了其它随机选择的文库克隆外，PKSI中预筛选的阳性克隆转化到S. lividans TK24. 细胞在各种培养基下生长，总共2500抽提物，1700来自E. coli 并且800 from S.lividans (corresponding to 480 and 40 E. coli and Streptomyces clones, respectively？), 进行了液相分析，使用的是光敏二极管列阵检测器。 What？ 1．土壤环境文库的特征： a.测序分析了17个土壤文库克隆DNA，插入片断中土样DNA GC%从 53 －70%. 表明E. coli宿主（平均GC%为51%）, 没有展现出对高GC DNA严重的GC偏向性。与前人报道的一致； b.从47个环境DNA文库克隆（代表整个文库克隆的1％）中扩增了rRNA基因序列，序列分析证实所有47个序列是唯一的并且文库似乎源于系统发生多样性的微生物，其中许多未曾分离或筛选过。大部分序列分析属于多变细菌类（文章未显示相关数据）。与前人报道的一致。 c.文库的系统发生分析显示出极其多样性，表明大部分微生物都未曾报道过。然而，最重要的是，文章是直接对文库克隆开展的多样性分析，而不是对土样DNA的分析，因此，到目前为止，延伸了以前的结果，多样性存在于大的DNA片断并克隆于载体构建了环境DNA文库。 2．利用PCR筛选文库中类似I型聚酮合酶克隆： a.筛选文库中含PKS I DNA序列的克隆：文库克隆96孔池PCR分析检测到10 （1st primer pair） and 15（2nd primer pair）个阳性克隆，对其中一些进行克隆、测序。获得了12个差异核苷酸序列。预测氨基酸序列的比对分析表明11个核苷酸序列编码的高度保守区对应于PKS I基因的KS（酮基合成酶）活性位点保守区。进一步在GenBank数据库中比对克隆的土壤DNA序列表明所有克隆的土壤PKS I序列均是新颖序列并且与已知的微生物PKS I基因序列高度同源。图1总结了这些分析结果。尤其是，最高同源值发现在粘细菌（橙色标桩菌），蓝细菌(Microcystis and Nostoc)，和分支杆菌属。来自土壤的PKS I克隆序列与红霉素聚酮化合物基因簇同源性53％。 b.11个差异的PCR产物中，三个来自同一个粘粒，a26G1,表明该粘粒插入基因片断编码至少三个不同的PKS I模块。文章测定了整个插入序列（图.2）。用Frame-Plot分析序列揭示了6个方向一致的大的ORFs, 在三处上游ORF与下游的起始密码子重叠。第一个和最后一个ORF不完整。第一个ORF编码装配非核糖体肽(NRPS)； 第二个ORF装配一个蛋白，包含一个NRPS和一个PKS模块。ORFs 3, 4, 5, and 6都装配PKS，每一个ORF（或部分ORF6）仅编码一个模块。预测的这些ORFs与粘细菌PKS和NRPS模块中涉及S. aurantica中的myxothiazole和Sorangium cellulosum中的epothilone生物合成的基因簇具最高相似性。插入片段GC％为64%，与粘细菌DNA GC含量相当。结果表明至少获得了8个新颖的聚酮合酶基因克隆。 C.小结：以热门的PKS I基因作为例，文章对其进行研究来评估环境DNA文库中潜在的令人感兴趣的天然产物的富度。从相对随机和小的DNA样品库（250Mb）中，发现了11个PKS I基因序列，该结果比预期的高得多。a26G1中编码的不完整NRPS/PKS途径强有力的表明：若文库包含更多的克隆和更大的插入片段，完全有理由期待在文库中找到完整的PKS基因簇或其它生物合成基因。 3. 文库生物学活性克隆筛选： a．抗细菌活性克隆筛选：检测到在E. coli中表达的一个抗细菌活性克隆(clone a10B12)。尽管抗细菌活性表型似乎是由粘粒中插入片段编码的小分子组成，并且在E. coli抽提物中检测到小分子，但在我们检测化合物结构之前活性丧失。可能由于E. coli.的强烈负选才使得该分子得以表达。 b．卡那抗性的基因克隆筛选：检测到一个卡那抗性克隆(clone a8E12)。卡那抗性在E. coli中稳定表达，并对粘粒中插入的DNA进行了测序，尽管ORF很可能不是编码抗生素的生物合成基因簇部分，但它确实编码的是一个推测的与几个属（包括假单胞菌属和链霉菌属）的氨基糖苷类乙酰基转移酶高度同源的蛋白（图3）。 C．卡那抗性克隆转化到S. lividans 中的异源表达：粘粒a8E12转化到S. lividans 中，但并没有在宿主中表达卡那抗性，强调使用多重表达系统捕获更广泛的可能活性的重要性。 D．额外的粘粒克隆的异源表达表型分析和液相检测分析：一些额外的粘粒克隆（包括a10B12 和编码PKS I的同源克隆) 转化到S.lividans TK24 和S. lividans 衍生菌（内原色素基因缺失，A. Martinez, unpublished results). 尽管在内原色素基因缺失的衍生菌中并没有发现抗细菌活性，但克隆a22G9 （30个测试的克隆之一）导致S. lividans TK24产生过度的蓝色色素(actinorhodin), 暗示了异源分子的产生(Martinez, unpublished). 液相分析菌株TK24 抽提物，携带该粘粒的菌株显示了两个新的峰而仅携带原始粘粒的宿主菌对照中并未出现（图4）。 4．液相筛选结果： A．12，000峰中，大于100个峰能与UV库相匹配（也就是菌中不存在的）。这些峰中的绝大多数低于可靠的纯度域值并省略了进一步的分析。 B．然而，两株重组菌，S. lividans克隆a24H2和a24A3, 色谱图相同, 包含的峰揭示了宿主菌中检测不到的同源化合物的存在。确定了分析的最佳的平等条件，文章分离了一系列6个高度相关的化合物，他们的UV谱几乎完全一样。这些条件下的液相色－质谱测定法分析，其中4个产生一个相对原子量为294。液体色谱法－核磁共振光谱测定了化合物的结构（图5）。这些脂肪丁烯均聚酒精异构体未曾在(4; Chemical Abstracts databases through 1999; American Chemical Society, Washington, D.C.)文献中报道过。 |
| So？ 1．文库插入片段GC%从 53 －70%，没有严重的GC偏向性；所有测定rRNA基因序列均是唯一的且源于系统发生多样性的微生物，其中许多未曾分离或筛选过，大部分序列分析属于多变细菌类。展现了插入片段DNA库的新颖性和多样性。与前人不同的是，新颖性和多样性是基于粘粒大克隆中的DNA进行分析的，而不是小的基因片段。 2．文库克隆96孔池PCR测序分析检测到11个类似PKS I中KS（酮基合成酶）的克隆。所有克隆均是新颖的克隆，与粘细菌（橙色标桩菌），蓝细菌(Microcystis and Nostoc)，和分支杆菌属有最高同源性。其中三个来自同一个粘粒a26G1, 获得了8个新颖的聚酮合酶基因克隆。粘粒a26G1经测序GC％为64%，预测为PKS/NRPS杂合基因簇，与S. aurantica中的myxothiazole和Sorangium cellulosum中的epothilone生物合成的基因簇具最高相似性，但基因簇不完整。若文库包含更多的克隆和更大的插入片段，则完全有理由期待在文库中找到完整的PKS基因簇或其它生物合成基因。 3. 文库生物学活性克隆筛选：通过两种宿主菌中异源表达、抗细菌活性、卡那抗性、液相分析进行克隆筛选，检测到5个具有新分子表达的克隆。但抗细菌克隆a10B12在检测异源化合物结构前活性丧失，可能由于E. coli.的强烈负选才使得该分子得以表达。卡那抗性克隆(clone a8E12)，抗性在E. coli中稳定表达，测序推测为氨基糖苷类乙酰基转移酶高度同源的蛋白，但并没有在S. lividans宿主中表达卡那抗性，强调使用多重表达系统捕获更广泛的可能活性的重要性。克隆a22G9导致S. lividans TK24产生过度的蓝色色素, 液相分析显示了原宿主菌没有的两个新峰。克隆a24H2和a24A3在宿主S. lividans检测到新化合物的存在并测定了结构，化合物未报道过。 总结：文章对文库克隆的分析表明文库具有相当的多样性和新颖性，开发以前未知或非培养微生物来发现新颖的天然产物具有潜在的价值，最重要的是，文章证实了一条非常有前途的开发药物的现实、有效的策略，进一步通过构建更大插入片段的环境文库、在多宿主系统中表达分析、预筛选分析的改进将大大的加强检测到新颖和有用次级代谢物的能力。 不足之处： 文章拿到了较为丰富的数据集，并且涉及到各种实验方法手段，提出开发药物的策略和改进方向，但不足之处是耗资巨大而并没有获得真正有价值的新化合物。 希望今后有更多的药物开发文献分析讨论，末学学识潜薄，缺陷之处望高手多多指教 |
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