主题：生物试验中化学发光的标记

吖啶酯以及相关化合物

通过简单的加入氢氧化钠以及过氧化氢就可以使吖啶酯标记的抗原或抗体发光，这种抗原或抗体采用一种活性标记物[2',6'-dimethyl-4'-(N-succinimidyloxycarbonyl) phenyl 10-methylacridinium-9-carboxylate]来获得。发光过程非常短暂，只是快速的一闪，持续时间小于5s。这么短暂的发光过程给反应的起始与测量带来了一定的限制(Weeks et al．1983，Law et al．1989)。通常是将试剂直接注入放在光度计暗仓内光探测器前面的试管内来检测发光。吖啶酯以及氨甲酰吖啶类似物[acridinium-9-(N-sulronyl) carboxamide](Kinkel et al．1989，Mattingly 1991)是用于免疫分析的主要化学发光标记物(可从Assay Designs lnc，Athens，GA；Behringwerke AG，Marburg，Germany；Ciba Coming Diagnostics，Medfield，MA以及Molecular Light Technology Research Ltd，Cardiff，UK等处获得)。这类标记的检测的最小量为~0.5attomol(0.5X10-18mol)。

基于杂交保护的非分离DNA探针分析(nonseparation DNA probe assay)方法已被设计出来(Arnold et al．1989)。这种类型的分析无需将结合与未结合的标记物分开，因而分析可方便的一步完成。这种杂交保护分析利用已与互补DNA杂交的吖啶酯标记探针与溶液中游离探针之间水解速率相差百万倍的特性，在pH7.6的硼酸缓冲液中破坏游离探针的化学发光特性，从而使水解后的化学发光仅仅来源于已杂交的标记探针(可从Gen-Probe，San Diego，CA获得)。



鲁米诺及其类似物

鲁米诺(Luminol)是第一个用于免疫学分析标记的化学发光化合物(Schroeder et al．1978)。在合适的催化剂(辣根过氧化物酶、微过氧化物酶(microperoxidase)、铁氰化物)存在的情况下，通过加入氧化剂(如：过氧化氢)可导致发光。然而，通过鲁米诺的5-氨基进行标记会使发光量减少10倍。异鲁米诺，一种鲁米诺6氨基异构体，其发光效率较鲁米诺低(量子产额0.1％)，但当通过第6位进行标记时可使发光量增加10倍。因而，这种化合物以及其氨基取代类似物，比如ABEI(N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol)，已在免疫分析应用中成为最受欢迎的标记物(Kohen et al．1979；Pazzagli et al．1982)。

吡啶哒嗪(Pyridopyridazines)代表另一类化学发光化合物。早期的数据显示这些化合物，尤其是8-氨基-5-氯-7-苯基和8-羟基-7苯基衍生物，可作为检测过氧化物酶标记的标记和协同底物(co-substrates)。与鲁米诺相比，这类化合物具有很强的化学发光特性(约为50倍)(Masuya et al．1992)。



碱性磷酸酶

磷酸金刚烷基1,2-二氧杂环丁烷(如：AMPPD；disodium 3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.13,7]decan]-4-yl)-phenylphosphate)以及5-位取代类似物(如：5-choro：CSPD；可从Tropix Inc获得)已成为碱性磷酸酶标记的最为广泛使用的化学发光底物(Bronstein et al．1989，1990，1991；Schaap et al．1989)。这种酶的检测极限是1 zeptomole(10-21摩尔)并且其发光持续时间超长(>1h)，因而特别适合与基于膜的分析。这个反应的发光强度可被尼龙膜表面以及特定的多聚物增强，如：聚氯苄(苄基二甲基铵)乙烯(polyvinylbenzyl(benzyldimethylammonium)chloride)。

对尼龙膜来说，这种增强作用是用于其疏水性基团对去磷酸化的反应中间体的螯合作用；从而稳定和减少中间体的非发光性降解。碱性磷酸酶标记的化学发光分析目前被广泛地用于印迹试验以及DNA序列测定(Beck and Koster 1990，Tizard et al．1990)。



beta-半乳糖苷酶

AMPGD(Adamantyl 1,2-dioxetane aryl galactoside)做为这种酶的底物现已越来越流行。这种酶从芳香环的第3位裂解半乳糖苷基团产生一种苯氧化物中间体，这种中间体的降解可导致发光。对这种酶采用这种分析方法的检测极限为30zeptomol。



辣根过氧化物酶

鲁米诺以及其他环状二酰基酰肼(cyclic diacylhydrazides)化合物是辣根过氧化物酶的化学发光协同底物。采用鲁米诺、过氧化氢，以及一种增效剂(如：4-碘苯酚或4-羟基肉桂酸)，辣根过氧化物酶的碱性同工酶可被检测出的最小量<5 atto mol(5X10-18摩尔)(Whitehead et al．1983；Thorpe et al．1985；Thorpe and Kricka 1986)。过氧化物酶的酸性同工酶被增强的效率较低。增效剂的作用是增强发光亮度并减少由于过氧化物或其他氧化剂导致鲁米诺氧化所产生的背景发光。这种双重效果能奇迹般地使过氧化物酶活性的分析以及分析的信噪比增强数千倍(这种增强化学发光试剂可从Airiersham获得)。过氧化物酶的这种灵敏的检测方法(较比色分析的灵敏度高10倍以上)已经与CARD方案[催化的报道者沉积方案(catalyzed reporter deposition protocol)]有效的结合(Wigle et al．1993)。在这个放大方案中，过氧化物酶标记与酪胺生物素底物反应所产生的高活性基团再与标记物以及与标记物直接相邻的任何蛋白反应。然后，沉积的生物素与链亲和素过氧化物酶作用(通过这种方式，原来的过氧化物酶标记被放大了许多倍)，从而使结合的过氧化物酶通过增强的化学发光法得到检测。采用CARD与化学发光分析相结合的方法，与沉积过氧化物酶比色分析(colorimetric detection)相比可使灵敏度显著提高。



黄嘌呤氧化酶

采用鲁米诺以及铁EDTA络合物可对此酶进行分析(Baret et al．1990，Baret and Fert 1990)。反应的灵敏度很高(检测极限为3atto mol)。采用黄嘌呤氧化酶催化的化学发光反应的显著特点是发光的持续时间非常长(>96h)。



葡萄糖氧化酶

目前已经发展了几种用于葡萄糖氧化酶的法学发光分析。异鲁米诺或鲁米诺在微过氧化物酶催化剂存在的情况下可用于分析葡萄糖氧化酶与葡萄糖反应所产生的过氧化物(Sekiya et al．1991)；另一种方法是采用化学发光荧光基团致敏的bis(2,4,6-trichlorophenyl)oxalate反应来检测(Arakawa et al．1982)。



商业试剂、试剂盒及光度计

对于可获得的化学发光试剂和试剂盒以及用于发光测定的光度计的全面的评述已有发表(请参见Stanley 1992，1993)。一系列关于化学发光在基础及应用领域的当前进展的资料汇编也同样可以得到(请参见Kricka and Stanley 1992，Kricka et al．1993，Wilkinson 1998)。化学发光可采用一系列的检测设备来进行检测，包括光电倍增管(采用光子计数或灵敏度较低的光子流模式(photon current mode))、硅光电二级管、CCD照相(Wick 1989)摄影或胶片摄影(Kricka and Thorpe 1986)。CCD照相由于是检测二维光源(如膜以及96孔微板)的方便且灵敏的方法而被广泛使用。除此以外，它还能容易的监测发光动力学、可通过图像增强以及背景减影来改善结果质量。