主题：【讨论】显微摄像知识三

浏览0 回复3 电梯直达

zhbvssong

结帖率：

100%

关注：0 |粉丝：0

新手级：新兵

发表于：2011/09/01 19:33:12 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

第三章显微镜的重要光学技术参数
在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。
显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。
一．数值孔径
数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。
数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（h）和孔径角（u）半数的正玄之乘积。用公式表示如下：
NA=hsinu/2
孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。
显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率h值。基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率h值大于一，NA值就能大于一。
数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。
这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值，
数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。
二．分辨率
分辨率又称“鉴别率”，“解想力”。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。
显微镜的分辨率用公式表示为：d=l/NA
式中d为最小分辨距离；l为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则d值越小，分辨率就越高。
要提高分辨率，即减小d值，可采取以下措施
1．降低波长l值，使用短波长光源。
2．曾大介质h值和提高NA值（NA=hsinu/2）。
3．增大孔径角。
4．增加明暗反差。
三．放大率
放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。
放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。
四．焦深
焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：
1．焦深与总放大倍数及物镜的数值孔镜成反比。
2．焦深大，分辨率降低。
3．由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。在显微照相时将详细介绍。
五．视场直径（Field of view）
观察显微镜时，所看到的明亮的原形范围叫视场，它的大小，是由目镜里的视场光阑决定的。
视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。
F=FN/Mob
F: 视场直径，FN：视场数，Mob:物镜放大率。
视场数（Field Number, 简写为FN），标刻在目镜的镜筒外侧。
由公式可看出：
1．视场直径与视场数成正比。
2．增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。
OLYMPUS SWH 目镜的视场数可达26.5 ,目前是世界上最大的。
六．覆盖差
显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。
国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm, 许可范围在0.16—0.18mm.,在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标科的确0.17,即表明该物镜要求盖玻片的厚度。
七．工作距离
工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。
在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。
数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。

第四章显微镜的光学附件
显微镜得不偿失光学部件包括物镜，目镜，聚光镜及照明装置几个部分。各光学部件都直接决定和影响光学性能的优劣，现分述如下：
一．物镜
物镜是显微镜最重要的光学部件，利用光线使被检物体第一次成象，因而直接关系和影响成象的质量和各项光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的首要标准。
物镜的结构复杂，制作精密，由于对象差的校正，金属的物镜筒内由相隔一定距离并被固定的透镜组组合而成。物镜有许多具体的要求，如合轴,齐焦。
齐焦既是在镜检时，当用某一倍率的物镜观察图象清晰后，在转换另一倍率的物镜时，其成象亦应基本清晰，而且象的中心偏离也应该在一定的范围内，也就是合轴程度。齐焦性能的优劣和合轴程度的高低是显微镜质量的一个重要标志，它是与物镜的本身质量和物镜转换器的精度有关。
物镜的种类很多，可从不同的角度分类，现分类介绍。
根据物镜相差校正的程度进行分类，可分为：
1．消色差物镜（Achromatic objective）:如OLYMPUS ACH10X，ACH40X，ACH100XO 等。这是常见的物镜，外壳上常有“Ach”字样。这类物镜仅能校正轴上点的位置色差（红，蓝二色）和球差（黄绿光）以及消除近轴点慧差。不能校正其它色光的色差和球差，且场曲很大。
２．复消色差物镜（Apochromatic objective）: 复消色差物镜的结构复杂，透镜采用了特种玻璃或萤石等材料制作而成，物镜的外壳上标有“Apo” 字样，如OLYMPUS UPLAPO 系列物镜，PLAPO 系列物镜等。参见图3（FIG3）。这种物镜不仅能校正红绿蓝三色光的色差，同时能校正红，蓝二色光的球差。由于对各种相差的校正极为完善，比响应倍率的消色差物镜有更大的数值孔径，这样不仅分辨率高，象质量优而且也有更高的有效放大率。因此，复消色差物镜的性能很高，适用于高级研究镜检和显微照相.
3．半复消色差物镜（ Semi apochromatic objedtive）: 半复消色差物镜又称氟石物镜，物镜，物镜的外壳上标有“FL”字样，如OLYMPUS UPLFL系列物镜。在结构上透镜的数目比消色差物镜多，比负消色差物镜少，成象质量上，远较消色差物镜为好，接近于复消色差物镜。参见图4平场物镜（Plan objective ）:平场物镜是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜，以达到校正场曲的缺陷。平场物镜的视场平坦，更适用于镜检和显微照象。
4．特种物镜：所谓“特种物镜”是在上述物镜的基础上，专门为达到某些特定的观察效果而设计制造的。主要有以下几种：
（1）带校正环物镜（Correction collar objective）:
在物镜的中部装有环装的调节环，当转动调节环时，可调节物镜内透镜组之间的距离，从而校正由盖玻片厚度不标准引起的覆盖差。调节环上的刻度可从0 .11--.023,在物镜的外壳上也标科有此数字，表明可校正盖玻片从0.11—0.23mm厚度之间的误差。如OLYMPUS UPLAPO４０Ｘ　0.11—0.23 mm C.C.
（2）带虹彩光阑的物镜（Iris diaphragm objective ）:　
在物镜镜筒内的上部装有虹彩光阑，外方也可以旋转的调节环，转动时可调节光阑孔径的大小，这种结构的物镜是高级的油浸物镜，它的作用是在暗视场镜检时，往往由于某些原因而使照明光线进入物镜，使视场背景不够黑暗，造成镜检质量的下降。这时调节光阑的大小，使背景变黑，使被检物体更明亮，增强镜检效果。
（3）相衬物镜（Phase contrast objective ）:
这种物镜是由于相衬镜检术的专用物镜，其特点是在物镜的后焦平面处装有相板，如　　　ＯＬＹＭＰＵＳ　ＵPLFL-PH系列物镜。
（4）无罩物镜（No cover objective ）:
有些被检物体，如涂抹制片等，上面不能加用盖玻片，这样在镜检时应使用无罩物镜，否则图象质量将明显下降，特别是在高倍镜检时更为明显。这种物镜的外壳上常标刻ＮＣ，同时在盖玻片厚度的位置上没有０.17的字样，而标刻着“０”。
（5）长工作距离物镜：
这种物镜是倒置显微镜的专用物镜，它是为了满足组织培养，悬浮液等材料的镜检而设计。　
二．目镜
目镜的作用是把物镜放大的实象（中间象）再放大一便，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。已知显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。因此，对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。
以OLYMPUS为例，目镜按规格来划分可分为：
1．长筒目镜：如SWHK 10X，WHK 10X，CWHK 10X ，NCWHK等等，此系列目镜应用于OLYMPUS CH-2，BH-2系列及CH30，CH20等显微镜。
2． UIS 新型目镜：如WH10X，SWH 10X 等等，此系列目镜是OLYMPUS 最新型目镜，应用于OLYMPUS CX2，BX2，AX 系列最新型显微镜。由于不同系列目镜光学设计不同，所以不能混用。
三．聚光镜
聚光镜又名聚光器，装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。
聚光镜的的结构有多种，同时根据物镜数值孔径的大小，相应地对聚光镜的要求也不同。
1．阿贝聚光镜（Abbe condenser）
这是由德国光学大学大师恩斯特。阿贝.(Ernst Abbe)设计。阿贝聚光镜由两片透镜组成，有较好的聚光能力，但是在物镜数值孔径高于0.60时，则色差，球差就显示出来。因此，多用于普通显微镜上。
2．消色差聚光镜(Achromatic aplanatic condenser ) 如OLYMPUS “U- AAC” 聚光镜：
这种聚光镜又名“消色差消球差聚光镜”和“齐明聚光镜”它由一系列透镜组成，它对色差球差的校正程度很高，能得到理想的图象，是明场镜检中质量最高的一种聚光镜，其NA值达1.4 。因此，在高级研究显微镜常配有此种聚光镜。它不适用于4 X以下的低倍物镜，否则照明光源不能充满整个视场。
3．摇出式聚光镜（ Swing out condenser）如 OLYMPUS “U-SC”聚光镜：
在使用低倍物镜时（如4X），由于视场大，光源所形成的光锥不能充满真整个视场，造成视场边缘部分黑暗，只中央部分被照亮。要使视场充满照明，就需将聚光镜的上透镜从光路中摇出。
参见图7 从左到右分别为：U-AAC，U-AC，U-ULC U-SC
4．其它聚光镜：
聚光镜除上述明场使用的类型外，还有作特殊用图的聚光镜。如暗视野聚光镜（U—DCD），相衬聚光镜(U-PCD)，偏光聚光镜(U-POC)，微分干涉聚光镜等，以上聚光镜分别适用于相应的观察方式。另外OLYMPUS 的万能聚光镜 U—UCDB 可以同时完成以上功能。
四．显微镜的照明装置
显微镜的照明方法按其照明光束的形成，可分为“透射式照明”，和“落射式照明”两大类。前者适用于透明或半透明的被检物体，绝大数生物显微镜属于此类照明法；后者则适用于非透明的被检物体，光源来自上方，又称“反射式或落射式照明。主要应用与金相显微镜或荧光镜检法。
1．透射式照明
透射式照明法分中心照明和斜射照明两种形式：
（1）中心照明：这是最常用的透射式照明法，其特点是照明光束的中轴与显微镜的光轴同在一条直线上。它又分为“临界照明”和“柯勒照明”两种。
A．临界照明（Critical illumination）:这是普通的照明法。这种照明的特点是光源经聚光镜后成象在被检物体上，光束狭而强，这是它的优点。但是光源的灯丝象与被检物体的平面重合，这样就造成被检物体的照明呈现出不均匀性，在有灯丝的部分则明亮；无灯丝的部分则暗淡，不仅影响成象的质量，更不适合显微照相，这是临界照明的主要缺陷。其补救的方法是在光源的前方放置乳白和吸热滤色片，使照明变得较为均匀和避免光源的长时间的照射而损伤被检物体。
B．柯勒照明：柯勒照明克服了临界照明的缺点，是研究用显微镜中的理想照明法。这中照明法不仅观察效果佳，而且是成功地进行显微照相所必须的一种照明法。光源的灯丝经聚光镜及可变视场光阑后，灯丝象第一次落在聚光镜孔径的平面处，聚光镜又将该处的后焦点平面处形成第二次的灯丝象。这样在被检物体的平面处没有灯丝象的形成，不影响观察。此外照明变得均匀。
观察时，可改变聚光镜孔径光阑的大小，使光源充满不同物镜的入射光瞳，而使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径匹配。同时聚光镜又将视场光阑成象在被检物体的平面处，改变视场光阑的大小可控制照明范围。此外，这种照明的热焦点不在被检物体的平面处，即使长时间的照明，也不致损伤被检物体。
（2）斜射照明：这种照明光束的中轴与显微镜的光轴不在一直线上，而是与光轴形成一定的角度斜照在物体上，因此成斜射照明。相衬显微术和暗视野显微术就是斜射照明。
2．落射式照明
这种照明的光束来自物体的上方通过物镜后射到被检物体上，这样物镜又起着聚光镜的作用。这种照明法是适用于非透明物体，如金属，矿物等。
五．显微镜的光轴调节
在显微镜的光学系统中，光源、聚光镜、物镜和目镜的光轴以及光阑的中心必须与显微镜的光轴同在一直线上，所以在镜检前必须进行显微镜光轴的调节，否则不能达到最佳观察效果。
1．光源灯丝调节：旧式显微镜需要调节灯泡的位置。目前的新型显微镜的光源已经进行了予定心设置，所以不需要调整。
2．聚光镜的中心调整：实际上显微镜光轴的调整的重点即是聚光镜的位置调整。
首先将视场光阑缩小，用10X物镜观察，在视场内可见到视场光阑的轮廓，如果不在中央，则利用聚光镜外侧的两个调整螺钉将其调至中央部分，当缓慢地增大视场光阑时，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓象完全与视场边缘内接，说明已经和轴。和轴后再略为增大视场光阑，使轮廓象刚好处于视场外切或略大。
3．孔径光阑的调节：孔径光阑安装在聚光镜内，研究用显微镜的聚光镜的外侧边缘上都有科数及定位记号，这样便于调节聚光镜与物镜的数值孔径相匹配，原则上说更换物镜时需调整聚光镜的数值孔径，一般物镜的数值孔径乘0.6或0.8就是聚光镜的数值孔径。